1.3.7: Calorímetro- Microcalorimetría de Titulación- Interacción Enzima-Sustrato

La técnica de microcalorimetría de titulación se desarrolló con el objetivo de sondear las interacciones enzima-sustrato. [1,2] Al inicio del experimento, la célula muestra contiene una solución acuosa que contiene una cantidad conocida de una enzima macromolecular\(\mathrm{M}(\mathrm{aq})\). Las alícuotas inyectadas contienen una cantidad conocida de sustrato de\(\mathrm{X}\) tal manera que durante el experimento se describe la composición de la célula de muestra en términos del siguiente equilibrio químico.

\[\mathrm{M}(\mathrm{aq})+\mathrm{X}(\mathrm{aq}) \Leftrightarrow \mathrm{MX}(\mathrm{aq})\]

[Es importante señalar que el término sustrato se refiere a la sustancia química que está ligada (¿adsorbida?) por la enzima macromolecular. En los tratamientos de adsorción, el sustrato macromolecular adsorbe moléculas pequeñas.] En el límite de unión fuerte (ver más abajo), la mayor parte del sustrato inyectado al inicio del experimento está unido por la enzima. Pero gradualmente a medida que se agrega más sustrato, el número de sitios de unión libres disminuye hasta que finalmente todos los sitios están ocupados y por lo tanto no\(q\) se registra calor. La trama de\(\left[\mathrm{q} / \mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}\right]\) contra número de inyección en el caso del libro de texto es sigmoidal.

El equilibrio establecido en la celda de muestra se describe de la siguiente manera.

\ [\ begin {array} {llccc}
&\ mathrm {M} (\ mathrm {aq}) &\ mathrm {X} (\ mathrm {aq})\ quad<==> &\ mathrm {MX} (\ mathrm {aq}) &\\
\ text {At}\ mathrm {t} =0 &\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M}) &\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X}) & 0 &\ mathrm {~mol}\\
\ texto { En}\ mathrm {t} =\ infty &\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M}) -\ xi &\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X}) -\ xi &\ xi &\ mathrm {mol}\\
& {\ left [\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M}) -\ xi\ derecha]/\ mathrm {V}} & {\ izquierda [\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X}) -\ xi\ derecha]/\ mathrm {V}} &\ xi/\ mathrm {V} &\ mathrm {mol }\ mathrm {dm}
\ end {array}\]

\(\mathrm{V}\)es el volumen de la celda de muestra. El análisis utiliza constantes de equilibrio definidas en términos de las concentraciones de sustancias químicas en el sistema. Existen ventajas en el uso de constantes de equilibrio teniendo la siguiente forma donde\(\mathrm{c}_{\mathrm{r} = 1 \mathrm{~mol dm}^{-3}\).

\[\mathrm{K}=(\xi / \mathrm{V}) \, \mathrm{c}_{\mathrm{r}} /\left\{\left[\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})-\xi\right] / \mathrm{V}\right\} \,\left\{\left[\mathrm{n}^{0}(\mathrm{X})-\xi\right] / \mathrm{V}\right\}\]

Este último es cuadrático en el grado de reacción,\(\xi\). [3]

\[\xi^{2}+b \, \xi+c=0\]

donde

\[ b=-n^{0}(M)-n^{0}(X)-V \, c_{r} \, K^{-1}\]

y

\[\mathrm{c}=\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M}) \, \mathrm{n}^{0}(\mathrm{X})\]

Por lo tanto

\[\xi=-(b / 2) \pm(1 / 2) \,\left(b^{2}-4 \, c\right)^{1 / 2}\]

La raíz negativa de la cuadrática produce la solución requerida con el argumento de que, con el aumento de\(n^{0}(\mathrm{X}\)\) en la célula de muestra, más sustrato está unido por la enzima. La cantidad requerida es\(\left(\mathrm{d} \xi / \operatorname{dn}_{\mathrm{X}}^{0}\right)\). Observamos que a partir de las ecuaciones (g) y (h),\[\mathrm{db} / \mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}=-1 ; \quad \mathrm{dc} / \mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}=\mathrm{n}_{\mathrm{M}}^{0}\]

En el experimento se controla la relación de cantidades totales de sustrato a enzima\(\mathrm{n}^{0}(\mathrm{X}) / \mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})\), lo que aumenta a medida que se agrega más sustrato a la célula de muestra. Una medida de la “estanqueidad de la unión” es la fracción de sustrato unido cuando esta relación es la unidad. \[\text { By definition, } \quad X_{r}=n^{0}(X) / n^{0}(M)=\left[X_{\text {total }}\right] /\left[M_{\text {total }}\right]\]

Definimos dos variables\(\mathrm{r}\) y\(\mathrm{C}\); (nota mayúscula). \[\mathrm{V} \, \mathrm{c}_{\mathrm{r}} / \mathrm{K} \, \mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})=\mathrm{c}_{\mathrm{r}} / \mathrm{K} \,\left[\mathrm{M}_{\text {total }}\right]=\mathrm{r}=1 / \mathrm{C}\]

\[\text { From equation (e), }[\mathrm{X}]^{\mathrm{eq}} /[\mathrm{MX}]^{\mathrm{eq}}=\mathrm{c}_{\mathrm{r}} / \mathrm{K} \,[\mathrm{M}]^{\mathrm{eq}}\]

Si\(\mathrm{K}\) es pequeño, entonces\(\mathrm{r}\) es grande y solo una pequeña cantidad del sustrato inyectado se liga a la enzima. \([\mathrm{X}]^{\mathrm{eq}}\)es, en términos relativos, grande y\([\mathrm{MX}]^{\mathrm{eq}\) pequeño. Si\(\mathrm{r}\) es grande,\(\mathrm{C}\) es pequeño.

Si por otro lado\(\mathrm{K}\) es grande,\(\mathrm{r}\) es pequeño,\(\mathrm{C}\) es grande y en el límite toda sustancia\(\mathrm{X}\) está unida a la enzima\(\mathrm{M}\).

Volvemos a la ecuación (i) porque para poder calcular\(\xi\) requerimos\(b\). [4]\[\mathrm{b}^{2}-4 \, \mathrm{c}=\left[\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})\right]^{2} \,\left[\mathrm{X}_{\mathrm{r}}^{2}-2 \, \mathrm{X}_{\mathrm{r}} \,(1-\mathrm{r})+(1+\mathrm{r})^{2}\right]\]

También\(\left[\mathrm{d} \xi / \operatorname{dn}^{0}(\mathrm{X})\right]\) se requiere que describa la dependencia del grado de unión al sustrato de la cantidad total de células\(\mathrm{X}\) en la muestra, señalando que podemos controlar esta última a través de la concentración de las alícuotas inyectadas. Volvemos a la ecuación (i) haciendo uso de la ecuación (n). [5]\[\frac{\mathrm{d} \xi}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}=\frac{1}{2}+\frac{\left[1-(1 / 2) \,(1+\mathrm{r})-\mathrm{X}_{\mathrm{r}} / 2\right]}{\left[\mathrm{X}_{\mathrm{r}}^{2}-2 \, \mathrm{X}_{\mathrm{r}} \,(1-\mathrm{r})+(1+\mathrm{r})^{2}\right]^{1 / 2}}\]

La entalpía de la solución en la celda de muestra (asumiendo que las propiedades termodinámicas de la solución son ideales) viene dada por la ecuación (p). \ [\ begin {alineado}
\ mathrm {H} (\ mathrm {aq};\ mathrm {id}) =\ mathrm {n} _ {1} (\ lambda)\,\ mathrm {H} _ {1} ^ {*} (\ lambda) +\ izquierda [\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M}) -\ xi\ derecha]\,\ mathrm {H} ^ {\ infty} (\ mathrm {M};\ mathrm {aq})\\
&+\ left [\ mathrm {n} _ {\ mathrm {X}} ^ {0} -\ xi\ derecha]\,\ mathrm {H} ^ {\ infty} (\ mathrm {X};\ mathrm {aq}) +\ xi\,\ mathrm {H} ^ {\ infty} (\ mathrm {MX};\ mathrm {aq})
\ end {alineado}\]

\[[\partial \mathrm{H}(\mathrm{aq} ; \mathrm{id}) / \partial \xi \xi]=-\mathrm{H}^{\infty}(\mathrm{M} ; \mathrm{aq})-\mathrm{H}^{\infty}(\mathrm{X} ; \mathrm{aq})+\mathrm{H}^{\infty}(\mathrm{MX} ; \mathrm{aq})=\Delta_{\mathrm{B}} \mathrm{H}^{\infty}\]

De ahí que la dependencia de la relación\(\left[\mathrm{q} / \mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}\right]\) sobre la composición de la celda de muestra viene dada por la ecuación (r). \[\frac{\mathrm{q}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}=\Delta_{\mathrm{B}} \mathrm{H}^{\infty} \,\left[\frac{1}{2}+\frac{\left[1-(1 / 2) \,(1+\mathrm{r})-\mathrm{X}_{\mathrm{r}} / 2\right]}{\left[\mathrm{X}_{\mathrm{r}}^{2}-2 \, \mathrm{X}_{\mathrm{r}} \,(1-\mathrm{r})+(1+\mathrm{r})^{2}\right]^{1 / 2}}\right]\]

Esta última ecuación clave describe el entalpograma registrado. Esta última cae en una de las tres clases generales determinadas por la cantidad\(\mathrm{C}\) en la ecuación (\(\lambda\)).

1. \(\mathrm{C} = \infty\). Todo el sustrato inyectado está unido a la enzima durante las primeras inyecciones de tal manera que la proporción\(\left[\mathrm{q} / \mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}\right]\) es igual\(\Delta_{\mathrm{B}} \mathrm{H}^{\infty}\). Cuando todos los sitios están ocupados, la relación\(\left[\mathrm{q} / \mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}\right]\) cae a cero y permanece en cero para todas las inyecciones posteriores.
2. \(40 < \mathrm{C} < 500\). Este es el caso del libro de texto donde el entalpograma registrado tiene forma sigmoidal. [6] La relación\(\left[\mathrm{q} / \mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}\right]\) a números de inyección bajos es cercana a\(\Delta_{\mathrm{B}} \mathrm{H}^{\infty}\). El entalpograma registrado se ajusta utilizando una técnica de mínimos cuadrados no lineales para producir estimaciones de\(\mathrm{K}\) y\(\Delta_{\mathrm{B}} \mathrm{H}^{\infty}\).
3. \(0.1 < \mathrm{C} < 20\). Solo una pequeña fracción del sustrato inyectado está unida a la enzima de tal manera que solo\(\Delta_{\mathrm{B}} \mathrm{H}^{\infty}\) se obtienen estimaciones pobres de\(\mathrm{K}\) y.

Notas al pie

[1] T. S. Wiseman, S. Williston, J.F.Brandts y Z.-N. Lim, Anal. Biochem., 1979, 179 ,131.

[2] M. J. Blandamer, en Biocalorimetría, ed. J. E. Ladbury y B. Z. Chowdhry, Wiley Chichester, 1998, p5.

[3]\(\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M}) \, \mathrm{n}^{0}(\mathrm{X})-\xi \,\left[\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})+\mathrm{n}^{0}(\mathrm{X})\right]+\xi^{2}=\mathrm{V} \, \mathrm{c}_{\mathrm{r}} \, \mathrm{K}^{-1} \, \xi\)

[4]\[b^{2}=\left[-n^{0}(M)-n^{0}(X)-V \, c_{r} \, K^{-1}\right]^{2}\]

\[\text { or, } b^{2}=\left[n^{0}(M)\right]^{2} \,\left[1+n^{0}(X) / n^{0}(M)+V \, c_{r} / K \, n^{0}(M)\right]^{2}\]

\ [\ begin {alineado}
\ mathrm {b} ^ {2} -4\,\ mathrm {c} =\ left [\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\ derecha] ^ {2}\, & {\ left [\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X})/\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X})/\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X})/\ mathrm {n} rm {M}) +1\ derecha.} \\
&\ izquierda. +\ mathrm {V}\,\ mathrm {c} _ {\ mathrm {r}}/\ mathrm {K}\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\ derecha] ^ {2} -4\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\,\ mathrm {rm {X})
\ final {alineado}\]

\[\text { Or, } b^{2}-4 \, c=\left[n^{0}(M)\right]^{2} \,\left[X_{r}+1+r\right]^{2}-4 \, n^{0}(M) \, n^{0}(X)\]

\[\mathrm{b}^{2}-4 \, \mathrm{c}=\left[\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})\right]^{2} \,\left[\left(\mathrm{X}_{\mathrm{r}}+1\right)^{2}+\mathrm{r}^{2}+2 \, \mathrm{r} \,\left(\mathrm{X}_{\mathrm{r}}+1\right)\right]-4 \, \mathrm{n}^{0}(\mathrm{M}) \, \mathrm{n}^{0}(\mathrm{X})\]

\[\mathrm{b}^{2}-4 \, \mathrm{c}=\left[\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})\right]^{2} \,\left[\mathrm{X}_{\mathrm{r}}^{2}+2 \, \mathrm{X}_{\mathrm{r}}+1+\mathrm{r}^{2}+2 \, \mathrm{r} \, \mathrm{X}_{\mathrm{r}}+2 \, \mathrm{r}-4 \, \mathrm{X}_{\mathrm{r}}\right]\]

[5] De la ecuación (i)\[\frac{\mathrm{d} \xi}{\mathrm{dn}_{\mathrm{x}}^{0}}=-\frac{1}{2} \frac{\mathrm{db}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{x}}^{0}}-\frac{1}{2} \, \frac{1}{2} \, \frac{1}{\left(\mathrm{~b}^{2}-4 \, \mathrm{c}\right)^{1 / 2}} \,\left[2 \, \mathrm{b} \, \frac{\mathrm{db}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{x}}^{0}}-4 \, \frac{\mathrm{dc}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{x}}^{0}}\right]\]

\[\text { Or, } \quad \frac{\mathrm{d} \xi}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}=-\frac{1}{2} \frac{\mathrm{db}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}-\frac{1}{2} \, \frac{1}{\left(\mathrm{~b}^{2}-4 \, \mathrm{c}\right)^{1 / 2}} \,\left[\mathrm{b} \, \frac{\mathrm{db}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}-2 \, \frac{\mathrm{dc}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}\right]\]

Ignoramos por el momento el término\(\left(b^{2}-4 \, c\right)^{1 / 2}\) y concentramos la atención en las dos derivadas\(\frac{\mathrm{db}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}\) y\(\frac{\mathrm{dc}}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}\); ecuación (j). \[\frac{\mathrm{d} \xi}{\operatorname{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}=\frac{1}{2}-\frac{1}{2} \, \frac{1}{\left(\mathrm{~b}^{2}-4 \, \mathrm{c}\right)^{1 / 2}} \,\left[-1 \,\left\{-\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})-\mathrm{n}^{0}(\mathrm{X})-\mathrm{V} \, \mathrm{c}_{\mathrm{r}} \, \mathrm{K}^{-1}\right\}-2 \, \mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})\right]\]

\[\text { Or, } \frac{\mathrm{d} \xi}{\mathrm{dn}_{\mathrm{X}}^{0}}=\frac{1}{2}+\frac{1}{2} \, \frac{1}{\left(\mathrm{~b}^{2}-4 \, \mathrm{c}\right)^{1 / 2}} \,\left[\mathrm{n}^{0}(\mathrm{M})-\mathrm{n}^{0}(\mathrm{X})-\mathrm{V} \, \mathrm{c}_{\mathrm{r}} \, \mathrm{K}^{-1}\right]\]

\ [\ begin {alineado}
&\ text {O,}\\
&\ frac {\ mathrm {d}\ xi} {\ nombreoperador {dn} _ {\ mathrm {X}} ^ {0}} =\ frac {1} {2} +\ frac {1} {2}\,\ frac {1} {\ left (\ mathrm {~b} ^ {2}} -4\,\ mathrm {c}\ derecha) ^ {1/2}}\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\,\ left [1-\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X})/\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M}) -\ mathrm {V}\,\ mathrm {c} _ {\ mathrm {r}}/\ mathrm {K}\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\ derecha]
\ end {alineado}\]

\ [\ begin {alineado}
&\ text {O,}\\
&\ frac {\ mathrm {d}\ xi} {\ mathrm {dn} _ {\ mathrm {x}} ^ {0}} =\ frac {1} {2} +\ frac {1} {2}\,\ frac {1} {\ left (\ mathrm {~b} ^ {2} -4\,\ mathrm {c}\ derecha) ^ {1/2}}\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\,\ left [2-\ left\ {1+\ mathrm {V}\,\ mathrm {c} _ {\ mathrm {r}}/\ mathrm { K}\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\ derecha\} -\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X})/\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\ derecha]
\ end {alineado}\]

\ [\ begin {alineado}
&\ text {O}\\
&\ frac {d\ xi} {\ nombreoperador {dn} _ {\ mathrm {X}} ^ {0}} =\ frac {1} {2}\
&+\ frac {1} {\ left (\ mathrm {~b} ^ {2} -4\,\ mathrm {c}\ derecha) {1/2}}\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\,\ left [1- (1/2)\,\ left\ {1+\ mathrm {V}\,\ mathrm {c} _ _ {\ mathrm {r}}/\ mathrm {K}\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\ derecha\} -\ izquierda\ {\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {X})/2\,\ mathrm {n} ^ {0} (\ mathrm {M})\ derecha\}\ derecha]
\ fin {alineado}\

Ahora considera el término\(\left(b^{2}-4 \, c\right)^{1 / 2}\). De la ecuación (n)\[b^{2}-4 \, c=\left[n^{0}(M)\right]^{2} \,\left[X_{r}^{2}-2 \, X_{r} \,(1-r)+(1+r)^{2}\right]\]

\[\text { But } \frac{\mathrm{d} \xi}{\mathrm{dn}_{\mathrm{x}}^{0}}=\frac{1}{2}+\frac{1}{\left(\mathrm{~b}^{2}-4 \, \mathrm{c}\right)^{1 / 2}} \, \mathrm{n}^{0}(\mathrm{M}) \,\left[1-(1 / 2) \,(1+\mathrm{r})-\mathrm{X}_{\mathrm{r}} / 2\right]\]

[6] J. E. Ladbury y B. Z.Chowdhry, Química y Biología, 1996, 3, 791.