7.9: Cromatografía en Columna (Fase Normal)
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La cromatografía en capa fina (TLC) se puede usar para separar muchas mezclas diferentes. Es muy flexible porque varios compuestos diferentes se pueden separar entre sí en un experimento.
Prácticamente hablando, la TLC a menudo se usa solo como una herramienta analítica y no como un método de purificación. Se utiliza para determinar rápidamente si una mezcla es pura, cuántos compuestos puede contener y qué combinación de eluyente y fase estacionaria se puede usar para separar los compuestos. Sin embargo, TLC a menudo funciona mejor con una cantidad muy pequeña de material. El aislamiento de cantidades útiles de compuesto a veces requiere otros tipos de cromatografía.
La cromatografía en columna es otro tipo de cromatografía líquida. Funciona igual que TLC. Se puede utilizar la misma fase estacionaria y la misma fase móvil.
En lugar de extender una capa delgada de la fase estacionaria sobre una placa, el sólido se empaqueta en una columna larga de vidrio. Por lo general, el sólido se suspende junto con el disolvente y se vierte en la columna. En ocasiones estas columnas son de varias pulgadas de ancho y unos pocos pies de largo. Una gran cantidad de material se puede purificar en una columna de cromatografía.
En lugar de dejar que el eluyente se absorba a través de la fase estacionaria, el disolvente se vierte en la parte superior de la columna y se deja pasar por gravedad. Aquí se aplican los mismos factores de adhesión y solución en TLC. Si se usa la misma fase sólida y fase líquida de TLC en una columna, los compuestos se eluirán a través de la columna en el mismo orden en que eluyen a través de una placa de TLC.
Para recolectar los compuestos separados, solo recolectamos la solución a medida que gotea por el extremo de la columna. Normalmente no podemos ver los compuestos, por lo que continuamente recolectamos fracciones. Eso podría significar recolectar un mL de solución en un tubo de ensayo, luego un mL en el siguiente tubo de ensayo, y así sucesivamente.
Después de recolectar varias fracciones, tendríamos que verificar para ver si contenían algo. Por lo general esto se hace por TLC. Tomamos cuidadosamente un tubo capilar y manchamos cada fracción varias veces en una placa TLC. Tomamos algo de solución de la primera fracción en un tubo capilar, golpecimos el tubo capilar en la placa TLC donde queremos mancharnos la muestra, y esperamos a que el disolvente se evapore. Después volvemos a golpear el capilar, exactamente en el mismo lugar. Vamos a repetir este ciclo algunas veces. Lo que estamos tratando de hacer es acumular suficiente compuesto en ese lugar para que podamos detectarlo (generalmente brillando una luz UV sobre él). Por supuesto, la fracción puede estar vacía, así que después de que se evapore el disolvente puede que no haya nada ahí de todos modos, pero no lo sabemos hasta que comprobemos.
Luego tomamos la siguiente fracción y hacemos lo mismo un poco más a lo largo de la placa TLC, y lo mismo con la fracción posterior a eso. Eventualmente tenemos una fila de manchas, cada una correspondiente a una fracción diferente. Cuando eluimos la placa TLC, idealmente nos gustaría ver fracciones que contengan solo una mancha, a un valor de Rf correspondiente a uno de los componentes de la mezcla original.
Recopilamos cualquier fracción que contenga compuesto puro y las evaporamos para obtener el compuesto aislado.
Figura\(\PageIndex{3}\): Comprobación de fracciones de cromatografía vía TLC.
Esa es la idea básica de una columna de cromatografía, pero veamos algunos detalles prácticos.
Lo primero en lo que hay que pensar es cómo configuramos la columna. Anteriormente dijimos que cargamos la fase estacionaria como una lechada, mezclada junto con la fase móvil ya. Alternativamente, a veces la fase estacionaria se vierte cuidadosamente en una columna ya llena de la fase móvil. Sería mucho más fácil simplemente agregar primero la fase sólida y estacionaria, luego verter la fase móvil. Ese enfoque viene con sus propios problemas.
El problema es que las fases estacionarias como la sílice suelen hincharse cuando entran en contacto con la fase móvil. Si viertes un poco de sílice en una columna, luego agrega solvente, los granos de sílice se hinchan y se vuelven mucho más abarrotados. Están tan abarrotados que no hay mucho espacio para que nada se mueva entre ellos. Si tienes un par de meses para sentarte y esperar a que tu compuesto se eluya a través de la columna, este método puede ser el adecuado para ti. De lo contrario, no lo intentes.
Como regla general, queremos que la fase estacionaria esté siempre cubierta en solvente. Si dejamos que la fase estacionaria se exponga al aire (si la dejamos secar y no reemplazamos el disolvente), ocurre lo contrario de la hinchazón. La fase estacionaria se contrae. Cuando se encoge, le entra grietas. A lo mejor notamos el problema y agregamos más solvente, pero para entonces puede que sea demasiado tarde. En lugar de moverse por la fase estacionaria como debería, todo simplemente se precipita por las grietas. No hay oportunidad para que ninguno de los compuestos de la mezcla se separe entre sí.
Por otro lado, se puede ir oveboard con solvente. Este es un problema particular al principio, cuando estás introduciendo la mezcla a separar. Lo que quieres hacer en este punto es dejar que el eluyente caiga exactamente al mismo nivel que la parte superior de la fase estacionaria, pero no más. Si cae más, la columna se seca. Por otro lado, si no dejas que caiga lo suficiente, tienes un problema igualmente grande.
Por lo general, la muestra se introduce como una solución concentrada en un poco del eluyente. A veces se seca sobre un poco de fase estacionaria haciendo una mezcla de muestra, fase estacionaria y un disolvente, luego evaporando el disolvente. De cualquier manera, la idea es obtener la muestra en una capa delgada en la parte superior de la columna. Queremos una capa fina porque la cromatografía es realmente una carrera y queremos que todas las moléculas estén en la misma línea de salida; no podemos tener a nadie con ventaja.
El problema de agregar demasiado disolvente en este punto es que parte de la muestra se disolverá y retrocederá al eluyente. Ya no tenemos una fina capa de muestra. No todo el mundo está en la misma línea de salida. Ahora se vuelve casi imposible separar la mezcla.
En su lugar, agregamos una pequeña cantidad de disolvente y dejamos que vuelva a caer hasta la parte superior de la fase estacionaria. Repite eso un par de veces (tres es un número mágico en el laboratorio). En este punto, probablemente hemos dibujado los compuestos hacia abajo en la columna lo suficientemente lejos como para que no quede ninguno en la parte superior de la fase estacionaria. Podemos agregar de manera segura más solvente sin lavar el material hacia atrás.
Eventualmente, querrás agregar tanto eluyente como puedas, porque la columna opera bajo gravedad. Cuanto más eluyente tengas por encima de la columna, más peso empuja hacia abajo para mover las cosas a través de la columna. La columna se acelera.
A veces, en lugar de dejar que el eluyente pase por la columna por gravedad, el eluyente puede ser empujado más rápidamente usando un gas inerte o una bomba de aire. Este método se llama cromatografía flash, y requiere algún equipo especial. Sin embargo, a veces hay una compensación entre la calidad de la separación y el tiempo que lleva ejecutar la columna.
¿Por qué podría haber menos separación entre dos compuestos si ambos se mueven a través de la columna más rápido?
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El método depende del tiempo adecuado para que los compuestos se diferencien entre sí a medida que se mueven por la columna. Si todos se mueven demasiado rápido, probablemente todos estén pasando demasiado tiempo en la fase móvil.
Supongamos que estás en medio de separar una mezcla en una columna de cromatografía cuando recuerdas que dejaste el horno encendido en tu departamento. Tu departamento está a media hora del laboratorio. Apagas la llave de paso en la parte inferior de la columna para que el eluyente deje de fluir. Cuando vuelvas, terminas la columna. Encuentras que no obtuviste muy buena separación entre los compuestos. ¿Qué pasó?
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Sin flujo para mantener las moléculas avanzando, los compuestos probablemente se difundieron en todas las direcciones mientras estaban en la fase móvil. Después de algún tiempo, algunos compuestos probablemente se habían extendido por toda la columna.
a) Supongamos que está trabajando con una columna de cromatografía que puede contener alrededor de 20 mL de solvente. Se sabe que una muestra generalmente se disuelve y luego se vierte en la parte superior de la columna antes de eluir con disolvente. Se disuelve la muestra en 20 mL de disolvente y se procede con el experimento. Obtienes muy malos resultados. ¿Qué salió mal?
b) Mientras tanto, la estudiante molestamente perfecta de la siguiente campana disuelve su muestra en 1 mL de solvente y corre su columna. Ella obtiene tres compuestos puros al final y el instructor inmediatamente le da una A en el curso. ¿Qué hizo bien?
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- Contestar a
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En lugar de tener una fina capa de muestra al principio, comenzamos con una capa muy ancha. Como resultado, para cuando algunas moléculas de un compuesto estaban emergiendo de la parte inferior de la columna, otras apenas comenzaban al principio. Las moléculas de otros compuestos ya estaban muy por delante de ellos y no pudieron ponerse al día.
- Respuesta b
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Ella mantuvo todas las moléculas juntas al principio para que las moléculas de un compuesto permanecieran todas juntas y llegaran al final de la comlumn al mismo tiempo.
La sílice y la alúmina no son las únicas fases sólidas posibles. Por ejemplo, una columna C18 contiene perlas que tienen cadenas de 18 carbonos unidas a ellas. Una columna C18 es un ejemplo de una columna de “fase inversa”, que a menudo se usan con disolventes como agua, metanol o acetonitrilo. En una columna normal, la fase estacionaria es más polar que la fase móvil; ¿es eso cierto en una columna de fase inversa?
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No. El disolvente es más polar que la fase estacionaria en este caso, por lo que más compuestos polares pasarán más tiempo en la fase móvil. Como resultado, los compuestos más polares en realidad se eluirán antes que los compuestos menos polares.