2.3F: Visualización de placas TLC

Los compuestos orgánicos suelen aparecer incoloros sobre el fondo blanco de una placa TLC, lo que significa que después de ejecutar una TLC, los químicos a menudo no pueden simplemente ver dónde se encuentran los compuestos. Los compuestos tienen que ser “visualizados” después de la elución, lo que significa convertirlos temporalmente en algo visible.

Los métodos de visualización pueden ser no destructivos (el compuesto no cambia después del proceso) o destructivos (el compuesto se convierte en algo nuevo después del proceso. Ver una placa TLC bajo luz ultravioleta no es destructivo, mientras que el uso de una mancha química es destructivo.

Resumen de visualización

A continuación se muestra un resumen de diversas técnicas de visualización, y los grupos funcionales que generalmente reaccionan con cada uno. Más adelante en esta sección se brinda una discusión más detallada de cada técnica.

Luz UV: Para aromáticos+sistemas conjugados	Yodo: Visualiza ~la mitad del tiempo. Reacciona fuertemente con los aromáticos	p-Anisaldehído: Para muchos aldehídos, cetonas y alcoholes	Vaillin: Para muchos aldehídos, cetonas y alcoholes
Permanganato: Para alquenos, alquinos o grupos oxidables (aldehídos, alcoholes)	Ácido fosfomolíbdico (PMA): Para alcoholes, fenoles, alquenos y muchos compuestos carbonílicos	Cloruro de Hierro (III): Para fenoles	Verde de Bromocresol: Para compuestos ácidos

Cuadro 2.4: Tabla resumida para los métodos de visualización TLC.

Absorción ultravioleta

El método de visualización no destructiva más común para placas TLC es la luz ultravioleta (UV). Una lámpara UV se puede usar para brillar la luz\(\left( 365 \: \text{nm} \right)\) ultravioleta de onda corta\(\left( 254 \: \text{nm} \right)\) o de onda larga en una placa TLC con solo tocar un botón. La mayoría de las placas TLC compradas comercialmente contienen un material fluorescente (por ejemplo, sulfuro de zinc) en la sílice o alúmina, por lo que el fondo de la placa aparecerá verde cuando se vea con luz UV de onda corta. Si un compuesto absorbe la luz\(254 \: \text{nm}\) UV, aparecerá oscuro, ya que el compuesto evita que el material fluorescente reciba la luz UV.

Este método es tan rápido y fácil que suele ser el primer método de visualización probado. Es muy útil para visualizar compuestos aromáticos y sistemas altamente conjugados, ya que estos absorben fuertemente los rayos UV. La mayoría de los otros grupos funcionales no absorben la luz UV a las longitudes de onda utilizadas y no aparecerán oscuros bajo la lámpara UV a pesar de que todavía están ahí. No está de más probar UV después de realizar TLC con todos los compuestos por si acaso. Dado que los compuestos permanecen inalterados después de la visualización con luz UV, posteriormente se puede usar una técnica de visualización adicional en la misma placa.

Figura 2.31: a) Inclinación de una lámpara UV para visualizar una placa TLC, b) Caja para proteger los ojos del daño UV, c) Apariencia bajo UV.

Procedimiento para la visualización UV de la placa TLC:

1. Use una lámpara UV para mirar su placa TLC desarrollada presionando el botón de onda corta. Dependiendo de lo que esté disponible en su institución, podría inclinar la lámpara UV en un ángulo en un área oscura de la habitación (Figura 2.31a), o podría mirar la placa dentro de una caja diseñada para proteger los ojos del daño UV (Figura 2.31b).
   
   Nota de seguridad: Se debe tener cuidado de no mirar nunca directamente la fuente UV y minimizar la exposición a los ojos.
2. El fondo de la placa aparecerá verde bajo luz UV de onda corta, y los compuestos activos UV aparecerán oscuros (Figura 2.31c). Use un lápiz para rodear ligeramente las manchas, ya que desaparecerán cuando se elimine la luz UV.
3. Algunos compuestos en sí mismos emiten fluorescencia (Figura 2.32), apareciendo una variedad de colores cuando se exponen a luz UV de onda corta o larga (el púrpura brillante o el azul es el más común). Registre este tipo de observaciones en su cuaderno si las ve, ya que son raras, y por lo tanto son una excelente herramienta de identificación. Son más comunes con compuestos altamente conjugados.

Figura 2.32: Soluciones de fluoresceína y rodamina B vistas con: a) Luz visible, b) UV de onda corta, c) UV de onda larga.

4. La placa TLC se puede visualizar adicionalmente con algún otro método si se desea (yodo o una tinción química).

Yodo

Un método de visualización semi-destructivo comúnmente utilizado es exponer una placa TLC desarrollada a\(\left( \ce{I_2} \right)\) vapor de yodo. “Se puede crear una “" cámara de yodo "” agregando algunos cristales de yodo a una cámara de TLC, o agregando algunos cristales de yodo a una cámara que contiene una porción de sílice o alúmina en polvo (Figura 2.33a).” Cuando se coloca una placa de TLC desarrollada en la cámara y se tapa, el yodo se sublima y reacciona con los compuestos de la placa, formando manchas amarillo-marrones (Figura 2.33d). La coloración ocurre porque el yodo forma complejos coloreados con muchos compuestos orgánicos. Esta mancha funcionará con aproximadamente la mitad de los compuestos que pueda encontrar.

Este método se considera “semi-destructivo” porque la complejación es reversible, y el yodo eventualmente se evaporará de la placa TLC, dejando atrás el compuesto original. Cuando la coloración se desvanece, teóricamente es posible utilizar otra técnica de visualización en la placa TLC, aunque es posible que el compuesto también se haya evaporado en ese momento.

Figura 2.33: a) Una cámara de yodo usando gel de sílice, b-d) Inserción de una placa en la cámara y empujón, e) Placa TLC desarrollada con yodo.

Procedimiento para la visualización de la placa TLC con yodo:

1. Si aún no está preparada, haga una “cámara de yodo” (Figura 2.33a): en una campana extractora, coloque unos centímetros de sílice o alúmina en polvo en una cámara TLC con tapa de rosca y agregue algunos cristales de yodo sólido (nota de seguridad: la sílice y la alúmina son irritantes pulmonares, y el vapor de yodo es considerado irritante y tóxico). Un vaso de precipitados y un vidrio de reloj no funcionarán en este contexto ya que los vapores de yodo escaparán. Deje que la sílice o la alúmina y el yodo se asienten juntos por un tiempo con remolinos periódicos, y eventualmente el polvo se volverá naranja por adsorber el vapor de yodo.
2. En una campana extractora, colocar la placa TLC desarrollada en la cámara de yodo con fórceps (Figura 2.33b) y cerrar la tapa. Agitar suavemente la cámara para enterrar la placa TLC en la sílice o alúmina teñida con yodo (Figura 2.33c) hasta que las manchas se coloreen (Figura 2.33d). Muchas manchas aparecerán de color amarillo-marrón casi de inmediato, y pueden oscurecerse con un tiempo prolongado. Para muchos compuestos, se tarda menos de 10 segundos en desarrollar una placa, pero algunos compuestos requieren 10 minutos o más. (Nota: los alcoholes, los ácidos carboxílicos y los haluros de alquilo a menudo no se tiñen.)
3. Registre puntualmente las observaciones apropiadas del TLC en su cuaderno, o circule las manchas con un lápiz, ya que los colores pronto se desvanecerán a medida que el yodo se evapore de la placa. Se puede intentar una visualización adicional después de que el color se desvanezca.

Manchas Químicas

Hay una variedad de métodos de visualización destructivos que pueden convertir compuestos incoloros en una placa TLC en manchas coloreadas. Una placa se pulveriza o se sumerge en un reactivo que experimenta una reacción química con un compuesto sobre la placa TLC para convertirlo en un compuesto coloreado, permitiendo que la mancha se vea a simple vista. Dado que en el proceso se está produciendo una reacción química, es común calentar suavemente una placa después de la exposición al reactivo para acelerar la reacción, aunque esto puede ser innecesario con algunas manchas. No todos los compuestos se pueden visualizar con cada reactivo si no reaccionan juntos, y las manchas a menudo están diseñadas para funcionar solo con ciertos grupos funcionales. La mancha específica debe elegirse en función de la estructura presunta de los compuestos que se desea visualizar.

Procedimiento General de Tinción

Figura 2.34: Secuencia de tinción mediante tinción de permanganato: a) Inserción de placa en la inmersión, b) Dejar que gotee, c) Limpiando el dorso, d) Calentar la placa con una pistola de calor.

1. Mientras usa guantes y sujeta la placa TLC con fórceps en una campana extractora, sumerja rápidamente la placa dentro y fuera del frasco de inmersión química para que la mancha cubra el área donde viajó el solvente sobre la placa (Figura 2.34b).
2. Deje que el exceso de líquido gotee del plato por unos segundos, luego limpie la parte posterior del plato con una toalla de papel (Figura 2.34c).
3. Caliente suavemente la placa para desarrollar las manchas. Preferiblemente usar una pistola de calor (Figura 2.34d), pero también se puede usar una placa calefactora (Figura 2.35, la carbonización es común).
   1. Si usa una pistola de calor, sostenga la placa TLC con fórceps y agite la pistola de calor hacia adelante y hacia atrás sobre la parte frontal de la placa. El ajuste “alto” se puede usar al principio, con el ajuste girado a “bajo” si la placa comienza a carbonizarse. Nota de seguridad: Las pistolas de calor no son simples secadoras de pelo, y pueden calentarse bastante. Tenga cuidado de no tocar la boquilla, y recuerde que permanece caliente durante mucho tiempo después de que el calentamiento haya cesado. Las boquillas calientes pueden incluso dañar las mesas de trabajo, así que tenga cuidado al colocar la pistola.
   2. Si usa una placa caliente, coloque la placa TLC sobre la superficie caliente (colocada entre baja y media-baja, y cubierta con papel de aluminio para evitar que los residuos de inmersión manchen la superficie cerámica). Mueva periódicamente la placa para distribuir el calor.

Figura 2.35: Uso de una placa calefactora para desarrollar manchas.

4. Una placa de TLC no se puede visualizar más después de usar una mancha.

Manchas de p-anisaldehído/vainillina

Generalidades

Las manchas de p-anisaldehído y vainillina son de propósito general y funcionan para muchos nucleófilos fuertes y débiles (alcoholes, aminas), y para muchos aldehídos y cetonas. No funcionan con alquenos, aromáticos, ésteres o ácidos carboxílicos. Las placas TLC necesitan calentarse suavemente y desarrollarán un fondo de rosa claro a rosa oscuro.

En la Figura 2.36 se muestra una TLC de cuatro muestras visualizadas con tres técnicas diferentes. La placa se visualiza con luz UV (Figura 2.36b), tinción de p-anisaldehído (Figura 2.36c) y tinción de vainillina (Figura 2.36d). La 4-heptanona (carril #1) y acetofenona (carril #2) mostraron coloraciones similares usando las dos manchas. El benzoato de etilo (carril #4) no fue reactivo a ambos. El cinamaldehído (carril #3) fue reactivo al p-anisaldehído pero no a la vainillina, mientras que su impureza (ácido cinámico, en la línea base del carril #3) mostró el comportamiento opuesto.

Figura 2.36: a) Estructuras de p-anisaldehído y vainillina. 4-Heptanona (carril 1), acetofenona (carril 2), cinamaldehído (carril 3) y benzoato de etilo (carril 4) visualizados con: b) luz UV, c) tinción de p-anisaldehído, d) tinción de vainillina.

Receta (p -anisaldehído): etanol\(135 \: \text{mL}\) absoluto\(\ce{H_2SO_4}\),\(5 \: \text{mL}\) concentrado, ácido acético\(1.5 \: \text{mL}\) glacial y\(3.7 \: \text{mL}\) p-anisaldehído. Esta mancha es susceptible a la degradación por la luz, así que almacene envuelta en papel de aluminio (Figura 2.37e), idealmente en el refrigerador cuando no esté en uso. En comparación con otras manchas, esta mancha tiene una vida útil algo corta (aproximadamente medio año). La mancha al principio será incolora (Figura 2.37a), pero con el tiempo se volverá rosa claro luego oscuro (Figura 2.37b-d). La mancha es menos potente cuando se oscurece, pero a menudo sigue siendo utilizable. Nota de seguridad: use guantes mientras usa esta mancha altamente ácida.

Receta (vainillina):\(250 \: \text{mL}\) etanol,\(15 \: \text{g}\) vainillina y\(2.5 \: \text{mL}\) concentrado\(\ce{H_2SO_4}\). Esta mancha es sensible a la luz y debe almacenarse envuelta en papel de aluminio en el refrigerador. Originalmente es de color amarillo claro, pero se oscurece con el tiempo (Figura 2.37f+g). Se debe desechar si adquiere un color azul. Nota de seguridad: use guantes mientras usa esta mancha altamente ácida.

Figura 2.37: a) Tinción de p-anisaldehído, al cabo de 1 semana de su preparación, b) Después de 10 semanas (tapado con papel de aluminio y en el refrigerador), c) Después de 20 semanas, d) Después de 30 semanas, e) Mancha cubierta con papel de aluminio para almacenamiento, f) Mancha de vainillina, tal como apareció inmediatamente después de la preparación, g) Después de 9 semanas.

Vías de reacción

Las manchas de p-anisaldehído y vainillina reaccionan de manera similar, y comúnmente experimentan reacciones de aldol y acetalización para producir compuestos altamente conjugados (y por lo tanto coloreados) en placas de TLC.

Reacciones aldol

Bajo las condiciones ácidas de la tinción, algunos aldehídos o cetonas pueden sufrir un tautomerismo ceto-enol, y el enol puede sufrir adición nucleofílica catalizada por ácido a p-anisaldehído o vainillina a través de un mecanismo aldólico. La deshidratación del producto aldólico (estimulada calentando la placa TLC), da como resultado un compuesto altamente conjugado (Figura 2.38d), razón por la cual las manchas se colorean.

Por ejemplo, una placa TLC que contiene acetofenona y benzofenona (como se ve con UV, Figura 2.38a), se tiñen con manchas de p-anisaldehído y vainillina. La acetofenona produjo una mancha coloreada con estas manchas (Figuras 2.38b+c) mientras que la benzofenona no. La principal diferencia es que la benzofenona no puede formar un enol, o ser un nucleófilo a p-anisaldehído, por lo que la tinción no es reactiva.

Figura 2.38: TLC de acetofenona (carril 1) y benzofenona (carril 2), usando hexanos:acetato de etilo 6:1 y visualizados con: a) luz UV, b) tinción de p-anisaldehído, c) tinción de vainillina, d) Una reacción propuesta de acetofenona con tinción de p-anisaldehído.

Reacciones de Acetalización

Algunos alcoholes reaccionan con manchas de p-anisaldehído y vainillina a través de reacciones de acetalización. Una reacción propuesta de p-cresol con p-anisaldehído se muestra en la Figura 2.39b para producir un catión altamente conjugado, una posible estructura de la mancha rosa en la placa TLC en el carril #2 de la Figura 2.39a. Esta estructura catiónica puede parecer inusual, pero es una estructura factible en las condiciones altamente ácidas de la mancha.

Figura 2.39: a) TLC de diversos fenoles visualizados con tinción de p-anisaldehído, b) Reacción propuesta de p-cresol (carril 2) con la tinción.

Tinción de Permanganato

El ion permanganato\(\left( \ce{MnO_4^-} \right)\) es de color púrpura profundo, y cuando reacciona con compuestos en una placa TLC (y se consume), la placa se deja con un color amarillo (Figura 2.40a). La mancha visualiza fácilmente alquenos y alquinos mediante reacciones de adición (Figura 2.40d), y el cambio de color suele ser inmediato con estos grupos funcionales.

El permanganato también es capaz de oxidar muchos grupos funcionales (por ejemplo, aldehídos, carril 1 en la Figura 2.40c), y así es considerado por algunos como una mancha universal. Se puede requerir calor para visualizar algunos grupos funcionales, y a menudo mejora el contraste entre las manchas y el fondo. El calentamiento se puede hacer (si es necesario) hasta que el color de fondo apenas comience a amarillear, pero un fondo marrón significa que la placa estaba sobrecalentada.

Figura 2.40: a) Producto bruto de una reacción de Grignard teñida con\(\ce{KMnO_4}\), b) Tarro de\(\ce{KMnO_4}\) reactivo, c) Placa TLC teñida con\(\ce{KMnO_4}\) (carril 1: heptaldehído, carril 2:2-metil-3-butin-2-ol, carril 3:1-metilciclohexeno), d) Mecanismo parcial para la reacción de alquenos con\(\ce{KMnO_4}\).

Receta:\(1.5 \: \text{g}\)\(\ce{KMnO_4}\),\(10 \: \text{g} \: \ce{K_2CO_3}\),\(1.25 \: \text{mL} \: 10\% \: \ce{NaOH} \left( aq \right)\), y\(200 \: \text{mL}\) agua. Nota de seguridad: use guantes mientras usa esta mancha, ya que el permanganato es corrosivo y manchará la piel de color marrón.

Tinción de ácido fosfomolíbdico

La tinción de ácido fosfomolíbdico (PMA) es considerada por algunos como una tinción universal, capaz de visualizar una amplia variedad de compuestos (alcoholes, alquenos, yoduros de alquilo y muchos compuestos carbonílicos). El reactivo PMA amarillo-verde\(\left( \ce{Mo^{6+}} \right)\) oxida el compuesto en la placa mientras se reduce a azul de molibdeno (\(\ce{Mo^{5+}}\)o\(\ce{Mo^{4+}}\)). Se requiere un calentamiento vigoroso para desarrollar las manchas, pero la placa se sobrecalienta cuando el fondo comienza a oscurecerse. Normalmente no hay diferenciación de color entre manchas, ya que la mayoría de los compuestos se visualizan como manchas verdes o azules (Figura 2.41c).

Figura 2.41: a+b) Tarro de reactivo de ácido fosfomolíbdico, c) Placa TLC teñida con el reactivo (#1: ácido benzoico, #2:2,6-di-t-butilfenol, #3:1-metilciclohexeno - no visto, pero las impurezas se tiñen, #4: alcohol bencílico), d) Fórmula de ácido fosfomolíbdico.

Receta: ácido\(5 \: \text{g}\) fosfomolíbdico en\(500 \: \text{mL}\) etanol. La mancha es sensible a la luz y por lo tanto debe almacenarse en un frasco bajo papel de aluminio. El reactivo es caro, pero la mancha tiene una vida útil muy larga (5+ años).

Mancha de Cloruro de Hierro (III)

La\(\left( \ce{FeCl_3} \right)\) tinción de cloruro férrico es altamente específica, y se utiliza principalmente para visualizar fenoles\(\left( \ce{ArOH} \right)\). También se pueden visualizar algunos compuestos carbonílicos con alto contenido de enol. \(\ce{Fe^{3+}}\)forma complejos coloreados con fenoles (a menudo azul tenue), en el sentido general de lo que se muestra en la Figura 2.42c. Se debate la estructura real de estos complejos\(^6\). La coloración se desvanece bastante rápido con esta mancha, por lo que las observaciones deben registrarse de inmediato.

Figura 2.42: a) jarra de\(\ce{FeCl_3}\) reactivo, b) placa TLC con diversos fenoles teñidos con\(\ce{FeCl_3}\), c) Complejo genérico de\(\ce{Fe^{3+}}\) color fenol.

Receta:\(1\%\)\(\ce{FeCl_3}\) en agua y\(\ce{CH_3OH}\) (\(50\%\)cada uno). Esta mancha tiene una alta vida útil (5+ años).

Colorante Verde Bromocresol

La tinción verde de bromocresol es específica para compuestos ácidos, y debe ser capaz de visualizar compuestos que produzcan una solución inferior a pH 5. La experiencia ha demostrado que los ácidos carboxílicos funcionan moderadamente bien (primer carril en la Figura 2.43d) pero los fenoles apenas son visibles (indicados con una flecha en la Figura 2.43d). En teoría, la placa no necesita calentarse después de la exposición a esta mancha, pero en la práctica suele mejorar el contraste entre las manchas y el fondo.

Figura 2.43: a) Una placa teñida con verde de bromocresol, b) tarro de tinción con verde de bromocresol, c) Ácido benzoico (carril 1) y p-cresol (carril 2) teñido con p-anisaldehído para mostrar la posición del p-cresol, d) La misma placa se tiñó con verde de bromocresol (p-cresol es muy débil y es indicado con una flecha).

Receta: etanol\(100 \: \text{mL}\) absoluto, verde de\(0.04 \: \text{g}\) bromocresol y\(0.10 \: \text{M} \: \ce{NaOH} \left( aq \right)\) gota a gota hasta que la solución cambie de amarillo a azul (el verde también funciona, como en la Figura 2.43b).

Esta mancha utiliza un indicador ácido-base, que funciona de manera similar a la fenolftaleína. El verde de bromocresol es amarillo por debajo de pH 3.8 y azul por encima de pH 5.4 (Figura 2.44a). Cuando se mancha un compuesto ácido en la placa, el ácido baja el pH y hace que el indicador se desplace a la forma amarilla de pH más bajo (Figura 2.44b).

Figura 2.44: a) Los colores de la tinción verde de bromocresol (izquierda = muy ácida, media = color del frasco de reactivo, derecha = pH más alto), b) Las estructuras químicas de las formas amarilla y azul del verde de bromocresol.

Resolución de problemas de visualización

El compuesto no se presentó

Incluso cuando un compuesto ciertamente se ha aplicado sobre la línea base de una placa de TLC, es posible que el compuesto no se vea en la placa después de la elución. Hay varias razones posibles para esto:

1. El compuesto puede estar demasiado diluido.

Una solución simple a un problema de dilución es agregar más compuesto a la muestra original y ejecutar la TLC nuevamente usando una placa nueva. Si se espera que el compuesto sea activo UV (es decir, si contiene un anillo aromático), es una buena idea ver la placa de TLC bajo luz UV antes de eluir la placa (Figura 2.45a). Si la mancha de muestra no es visible antes de la elución, no será visible después, ya que los compuestos se difunden durante la elución.

Si se determina que la muestra está ligeramente demasiado diluida, el material puede depositarse varias veces antes de la elución (Figura 2.45b). Para hacer esto, entregue una pequeña mancha de muestra en la línea base y déjela completamente seca (ayuda a soplar sobre ella) antes de entregar otra mancha sobre la primera. Si no se permite que las manchas se sequen entre aplicaciones, la mancha será demasiado grande. Si se espera que el compuesto sea activo UV, verifique la placa bajo luz UV, y si es necesario, manche más veces antes de la elución.

Figura 2.45: a) Uso de una lámpara UV para ver si se moteó suficiente muestra antes de la elución, b) Manchado múltiple, c) TLC visualizado con\(\ce{KMnO_4}\) (2-penteno estaba en el carril 1 y no se vio), d) 2-penteno sin diluir manchado en una placa de TLC de chatarra y visualizado con\(\ce{KMnO_4}\).

2. El compuesto puede haberse evaporado.

Una placa TLC debe visualizarse inmediatamente después de la elución, por lo que si se deja una cantidad moderada de tiempo entre ejecutar la TLC y visualizarla, la evaporación puede ser la causa del problema. Una solución a este problema es ejecutar de nuevo el TLC y visualizarlo de inmediato.

Si el compuesto tiene un punto de ebullición bajo, probablemente se evaporó durante la elución. Por ejemplo, se moteó 2-penteno (punto de ebullición\(36^\text{o} \text{C}\)) en el carril #1 de la Figura 1.45c. No se tiñó con permanganato después de la elución a pesar de que el compuesto es reactivo a la tinción (una muestra no diluida y no eluida de 2-penteno se tiñó algo en una placa de TLC de desecho, Figura 2.45d). Los compuestos con puntos de ebullición inferiores a aproximadamente\(120^\text{o} \text{C}\) son difíciles de analizar a través de TLC.

3. El compuesto puede ser no reactivo a la técnica de visualización.

Las técnicas de visualización a menudo se adaptan a ciertos grupos funcionales. Por ejemplo, la luz ultravioleta es generalmente buena para visualizar compuestos aromáticos pero pobre en otros grupos funcionales. Si UV, yodo o una mancha no logran visualizar un compuesto, podría significar que el compuesto simplemente no es reactivo a la técnica, y se debe probar otro método.

Por ejemplo, la Figura 2.46 muestra para diferentes compuestos visualizados con UV (Figura 2.46a), tinción de p-anisaldehído (Figura 2.46b) y yodo (Figura 2.46c). El compuesto en el carril #1 de todas las placas (4-heptanona) solo fue visible con tinción de anisaldehído (mancha azul), y no con UV ni\(\ce{I_2}\). El compuesto en el carril #4 de todas las placas (benzoato de etilo) no fue reactivo a la tinción de anisaldehído, pero pudo visualizarse con UV y\(\ce{I_2}\). La impureza presente en la línea base del carril #3 (la impureza ácido cinámico) fue fuertemente activa UV, pero difícilmente se pudo ver con las otras manchas.

Figura 2.46: Cuatro compuestos eluyeron con hexanos:acetato de etilo 6:1 y se visualizaron con 3 métodos: a) UV, b) p-anisaldehído, c) yodo\(^7\). Los compuestos fueron: #1:4-heptanona, #2: acetofenona, #3: cinamaldehído y #4: benzoato de etilo.

La marca de lápiz de UV es diferente a la mancha

La luz ultravioleta es a menudo la primera técnica de visualización que se intenta en una placa TLC eluida porque es no destructiva y bastante simple de llevar a cabo. Si se ve una mancha oscura con una lámpara UV, se acostumbra rodear la mancha con lápiz (como en la Figura 2.46b), ya que la mancha será invisible cuando se retire la lámpara. Otra técnica de visualización a menudo se lleva a cabo después de ver la placa bajo UV, y no es raro que la mancha posterior se extienda a una región más pequeña o más grande que la marca del lápiz.

Por ejemplo, el compuesto en el carril 2 de la Figura 2.46 (acetofenona) se puede ver fácilmente con luz ultravioleta (Figura 2.46a), pero en la placa visualizada con yodo (Figura 2.46c), las marcas de lápiz encapsulan una región más grande que la que se ve oscurecida por el yodo. Esto se debe a que la acetofenona es muy fuertemente activa contra los rayos UV, pero solo se compleja levemente con el yodo. No es raro que una técnica visualice un compuesto de manera más efectiva que otra técnica.

Por lo tanto, es importante tener cuidado al usar TLC para interpretar la cantidad de material presente en una muestra, por ejemplo al evaluar la cantidad de una impureza (como en el carril #3 de la Figura 2.46, que contiene cinamaldehído y su impureza ácido cinámico). Es probable que un punto grande esté presente en mayor cantidad que un punto pequeño, pero también podría ser que el punto grande sea más sensible a la técnica de visualización.

El color de una mancha se desvaneció o cambió con el tiempo

Es muy común que la coloración producida por una mancha se desvanezca con el tiempo, ya que los compuestos eventualmente se evaporan de la placa u se producen otras reacciones más lentas. Por esta razón, puede ser una buena idea rodear las manchas con lápiz inmediatamente después de que se visualice una placa, aunque como las manchas generalmente se encierran en un círculo después de verlas con UV, las marcas adicionales pueden causar confusión en cuanto a qué compuestos son UV activos. Otra alternativa es colocar cinta transparente a través de la placa para evitar que las manchas se evaporen.

Es posible que la coloración producida por una mancha cambie con calentamiento prolongado, o con el tiempo. Por ejemplo, la placa de la Figura 2.47 se visualizó con tinción de p-anisaldehído, y la Figura 2.47a muestra cómo apareció la placa inmediatamente después del calentamiento. La Figura 2.47b muestra cómo apareció la misma placa después de estar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El compuesto en el carril #2 (acetofenona) tuvo el cambio de color más dramático durante ese tiempo, cambiando de un color naranja brillante a un color verde. Las observaciones registradas en un cuaderno de laboratorio deben ser del color original de una mancha.

Figura 2.47: Los mismos cuatro compuestos utilizados en la Figura 2.46, todos visualizados con p-anisaldehído: a) La placa tal como se veía inmediatamente después del calentamiento, b) Después de 30 minutos, c) Otro ensayo de este mismo sistema después del tiempo.

La tinción no tiene sentido

Ciertos métodos de visualización funcionan mejor para ciertos grupos funcionales, por lo que un resultado positivo con una mancha puede dar pistas sobre la identidad de una mancha desconocida. Sin embargo, a veces un compuesto se mancha cuando no se “supone que debe”, y esto puede resultar confuso.

Figura 2.48: Placas TLC de: a) Benzaldehído con luz UV, b) Benzaldehído con tinción verde de bromocresol, c) Cinamaldehído con luz UV, d) Cinamaldehído con tinción verde de bromocresol.

Por ejemplo, una TLC de benzaldehído visualizada con luz UV (Figura 2.48a) muestra dos manchas, y en base a\(R_f\) valores relativos, tendría sentido que la mancha oscura sea benzaldehído y la mancha más débil cerca de la línea base sea ácido benzoico (causado por una oxidación del benzaldehído). La tinción de la placa con verde de bromocresol (una tinción para compuestos ácidos), respalda esta hipótesis ya que la mancha ácida inferior se visualiza con este método (Figura 2.48b). Este es un ejemplo de cuando los resultados de la tinción “tienen sentido estructural”, e incluso pueden apoyar la identificación de manchas desconocidas.

Sin embargo, en un experimento similar con cinamaldehído, tanto las manchas de aldehído como de ácido carboxílico se visualizaron fuertemente con verde de bromocresol (Figura 2.48d), aunque solo una es un compuesto ácido. Este resultado no “tiene sentido” al principio, y sólo se pueden postular teorías de por qué el aldehído reaccionó con la mancha.

La significancia de la Figura 2.48 es que la interpretación de la tinción o la falta de tinción a veces se puede utilizar para inferir la estructura, pero puede haber excepciones que son difíciles de explicar.

\(^6\)Ver Naturaleza 165, 1012 (24 Junio 1950); DOI: 10.1038/1651012b0

\(^7\)La placa de TLC se dejó en la\(\ce{I_2}\) cámara por solo aproximadamente 2 minutos, y las manchas pueden haberse desarrollado más con tiempo adicional.