2.3E: Procedimientos paso a paso para cromatografía en capa fina

Procedimiento general de TLC

La TLC que se muestra en esta sección muestra la elución de una placa TLC que contiene varias muestras de colorante alimentario rojo a diferentes diluciones acuosas (0 = sin diluir, 3 = 1 gota de colorante + 3 gotas de agua, etc.).

Figura 2.22: a) Tinte alimentario rojo manchado a diferentes diluciones, b) Elución, c) Placa de TLC desarrollada.

Disolver las muestras

1. Disuelva todas las muestras que desee procesar (sólidos y líquidos) en pequeños viales utilizando un disolvente volátil en el que sean solubles (por ejemplo, acetona, éter dietílico o diclorometano). Idealmente los viales tendrán una tapa para minimizar los vapores y conservar las muestras si se volcan (Figura 2.23a).
   
   La concentración óptima para TLC se determina típicamente empíricamente, pero un buen lugar para comenzar es usar 50-100 veces más disolvente que muestra (es decir, 1 gota de muestra para\(\sim 1 \: \text{mL}\) disolvente). Si ya has preparado una muestra de RMN (\(\sim 5 \: \text{mg} / 0.75 \: \text{mL}\)para RMN de campo alto), puedes usar esa muestra directamente.
   
   Etiquete los viales. También prepare un vial de acetona limpia (u otro disolvente, por ejemplo\(\ce{CH_2Cl_2}\)) para ser usado para enjuagar los spotters en un paso posterior. (Un vial de enjuague con agua se representa en la Figura 2.23a, ya que las soluciones de tinte son solubles en agua).

Figura 2.23: a) Muestras preparadas, b) Cámara de TLC hecha con vaso de precipitados y vidrio de reloj, c) Agregar eluyente a una cámara de TLC, d) Placa preparada.

Preparar la cámara de TLC y la placa

2. Obtener una cámara de TLC con tapa. Una cámara económica se puede hacer usando un vaso de precipitados y vidrio de reloj (Figura 2.23b). Corte un trozo de papel de filtro (o dos) para que cuando se coloque en la cámara, el papel de filtro se ajuste dentro de la cámara y quede plano en la parte inferior pero no oscurezca su vista del interior (Figura 2.23c).
   
   El papel de filtro mantiene la cámara saturada de vapores por lo que cuando el eluyente sube sobre la placa no se evapora fácilmente, sino que continúa escalando y sometiéndose a la cromatografía. Si el eluyente se evaporara, el movimiento se detendría, pero también podría cambiar la composición local de un eluyente mixto y afectar los resultados.
3. Agregar una porción de un disolvente preparado para cromatografía (Figura 2.23c,\(5\) -\(10 \: \text{mL}\) para este tipo de cámara de TLC). Cierre la tapa (o coloque el cristal del reloj) e incline la cámara para humedecer el papel de filtro.
4. Obtener una placa TLC, tocando la placa solo en la parte posterior o bordes, pero no en la superficie blanca. Usa una regla para dibujar ligeramente una línea recta con un lápiz\(^3\) aproximadamente\(1 \: \text{cm}\) desde la parte inferior. No gubias la sílice o la alúmina.

Figura 2.24: a) Muestra de colorante alimentario rojo manchada muchas veces, con flecha que indica la fluencia de la muestra en los bordes, b) Muestras diluidas de colorante alimentario rojo a diferentes diluciones - antes de la elución, c) después de la elución.

5. Etiquete las áreas con lápiz donde planea colocar las muestras (Figura 2.23d). Una placa TLC de una pulgada de ancho puede acomodar cómodamente tres muestras (tiene tres carriles), y si el tamaño del punto se mantiene pequeño, puede caber en un máximo de cinco puntos. Si se necesitan más de cinco manchas en una placa, las placas TLC se pueden comprar en hojas y cortar más de una pulgada.
   
   Los carriles no deben colocarse demasiado cerca del borde (mantener al menos\(5 \: \text{mm}\) lejos de cada borde), ya que no es inusual que el disolvente viaje ligeramente “rápido” en el borde donde la acción capilar del disolvente es mayor (Figura 2.24).
   
   Los carriles tampoco deben colocarse demasiado cerca uno del otro, o las manchas pueden superponerse después de la elución. Una mancha siempre es mayor después de la elución en comparación con su tamaño original (Figura 2.24b+c) porque la difusión se produce en todas las direcciones (el contacto con un líquido esparce el material tanto en la dirección horizontal como en la vertical). El ensanchamiento también ocurre a medida que los solutos en la fase móvil se mueven a diferentes velocidades ya que el flujo de eluyente es más débil cerca de la superficie del adsorbente. Esto incluso a veces puede hacer que los compuestos se atasquen en los poros adsorbentes donde el flujo de eluyente es especialmente débil. \(^4\). El ensanchamiento de manchas significa que las muestras depositadas una junto a la otra en la línea base de una placa de TLC probablemente sangrarán juntas durante la elución.

Figura 2.25: a) Inclinación del vial para extraer líquido en el spotter, b) Manchar muestras sobre una placa TLC, c) Exceso de muestra drenado sobre una toalla de papel, d) Enjuagar el spotter con disolvente (agua en este caso).

Colocar la placa de TLC con la muestra

6. Obtener un spotter capilar (una pieza hueca muy delgada de vidrio abierta en ambos extremos). En algunas instituciones, es posible que necesites hacer tu propio spotter estirando una pipeta ablandada. Coloca tu spotter en la muestra diluida que deseas analizar para extraer líquido en el spotter a través de la acción capilar. Si el nivel de líquido es bajo en su vial y su spotter corto, es posible que tenga que inclinar el vial para extraer líquido (Figura 2.25a).
7. Manteniendo el spotter mayormente vertical, haz un “spot” de práctica en una toalla de papel o desecha un trozo de sílice o alúmina para familiarizarte con la forma en que el líquido se entrega desde el spotter. Las manchas deben ser muy pequeñas, alrededor \(2 \: \text{mm}\)de diámetro. Entregue una mancha muy pequeña de material en la línea de lápiz del carril apropiado (Figura 2.25b) usando un rápido movimiento de “arriba y abajo” con la mano. No corte la sílice o la alúmina con el spotter.
8. Aún manteniendo el spotter vertical, inmediatamente toque el spotter con una toalla de papel para eliminar todo el líquido que queda en el spotter (Figura 2.25c). Si el spotter se coloca sin drenar inmediatamente el líquido, el aire puede entrar en el spotter haciendo que sea imposible dispensar y volver a usarlo.
9. Enjuaga el spotter con acetona (u otro solvente volátil con el que sean solubles tus compuestos, Figura 2.25d). Coloca el manchado vacío en tu vial de enjuague para retirar el líquido y escurrir el disolvente sobre una toalla de papel. Enjuague una o dos veces antes de reutilizar el spotter para otras muestras.

Figura 2.26: a) Usando fórceps para colocar la placa TLC en la cámara, b-d) Elución, e) Marcar la línea de solvente con un lápiz.

Colocar la placa TLC en la cámara para “eluir”

10. Use fórceps para colocar delicadamente la placa TLC en la cámara (Figura 2.26a). No permita que el líquido salpique sobre la placa.
    
    El nivel de líquido debe estar por debajo de la línea de lápiz donde se manchan las muestras o los compuestos se disolverán en el charco de eluyente en lugar de subir por el plato. Tapar la cámara delicadamente mientras la mantiene vertical, y no la vuelvas a tocar hasta que se complete el TLC.
11. Permitir que se desarrolle la TLC (Figura 2.26b-d). A medida que el líquido se mueve hacia arriba por la placa TLC, aparecerá transparente y húmedo. Un fondo oscuro permitirá que el frente solvente se vea más fácilmente. Si el eluyente es muy polar (por ejemplo, contiene grandes cantidades de etanol o agua), la elución llevará un tiempo relativamente largo (puede ser de 30-40 minutos). Si el eluyente es muy no polar (por ejemplo, contiene grandes cantidades de hexano o éter de petróleo), la elución será relativamente rápida (puede ser de 2-5 minutos para una placa\(10 \: \text{cm}\) alta).
12. Dependiendo de los objetivos del experimento de TLC, la cromatografía se puede detener cuando el nivel de disolvente está en cualquier lugar entre la mitad y aproximadamente\(0.5 \: \text{cm}\) desde la parte superior de la placa. Lo mejor es dejar que el TLC corra alrededor\(0.5 \: \text{cm}\) de la parte superior de la placa para obtener la mejor separación de manchas y minimizar el error en\(R_f\) los cálculos.

Retirar la placa TLC de la cámara

13. Abra la cámara de TLC y retire la placa de TLC con fórceps. Marque inmediatamente la línea de solvente con un lápiz (Figura 2.26e) para permitir un\(R_f\) cálculo, ya que el solvente a menudo se evapora fácilmente. Alternativamente, la sílice puede ser ligeramente ranurada con las pinzas para marcar el frente del disolvente.
14. Si los compuestos en la placa TLC están coloreados, el proceso es completo. Si los compuestos son incoloros, deben ser visualizados a continuación.

Resumen de cromatografía en capa fina

Colocar una pequeña porción de disolvente (\(5\)-\(10 \: \text{mL}\) para esta cámara) en una cámara TLC con tapa, junto con un trozo de papel de filtro cortado.	Disolver muestras líquidas o sólidas (1 gota por\(\sim 1 \: \text{mL}\) disolvente) usando un disolvente de bajo punto de ebullición (por ejemplo, acetona o diclorometano).	Dibuja una línea de lápiz en una placa TLC\(\sim 1 \: \text{cm}\) desde la parte inferior con una regla y marca los carriles. No pongas carriles demasiado cerca del borde ni el uno del otro. Coloca una muestra diluida en la línea de lápiz del carril correcto, haciendo manchas muy pequeñas (\(2 \: \text{mm}\)de diámetro). Enjuague el manchado con un disolvente (por ejemplo acetona) si va a usarlo para otra muestra.	Colocar la muestra en la cámara de TLC con fórceps, taparla y dejarla sola. Retire la placa cuando la línea de solvente esté\(\sim 0.5 \: \text{cm}\) desde la parte superior. Marque inmediatamente la línea de solvente con un lápiz. Visualizar si es necesario.

Cuadro 2.3: Resumen procesal para TLC.

Solución de problemas de TLC

Las manchas son rayadas o “blobby”

Los componentes de una muestra pueden aparecer como rayas largas o manchas “blobby” en una placa de TLC si las muestras se ejecutan a una concentración demasiado alta.

Por ejemplo, la Figura 2.27b muestra una placa TLC eluida que contiene cinco muestras de colorante alimentario rojo de diferentes concentraciones (el carril 0 contiene el colorante en la concentración que se encuentra en la tienda de abarrotes; el carril 3 contiene 1 gota de colorante diluido con 3 gotas de agua, etc.). Después de la elución, los componentes rojo y rosa del colorante sin diluir (carril 0) rayaron severamente, ya que la placa TLC estaba “sobrecargada”. Cuando esto sucede, no se produce un equilibrio adecuado entre las fases estacionaria y móvil. Con una dilución adicional (carril 12), las rayas desaparecieron y las formas de las manchas se agudizaron.

Si se observan estrías en una placa de TLC, la muestra debe diluirse y volver a procesarse.

Figura 2.27: a) Antes de la elución de muestras de colorante alimentario rojo a diferentes diluciones acuosas, b) Después de la elución, c) Muestras de alqueno y alquino demasiado concentradas (visualizadas con\(\ce{KMnO_4}\) tinción, d) Muestras de alqueno y alquino a dilución adecuada.

La Figura 2.27c también demuestra cómo la dilución puede mejorar la forma de una mancha después de la elución. En esta TLC, se mancharon muestras de alqueno y alquino a concentraciones algo altas, mientras que se utilizó una dilución mejorada en la Figura 2.27d. Observe cómo\(R_f\) parece cambiar en las dos placas TLC. El más preciso\(R_f\) es de la muestra diluida. La aplicación de TLC en muestras concentradas da\(R_f\) valores inexactos y puede ocultar múltiples manchas.

Las manchas corrieron de manera desigual

A veces, el frente de disolvente puede correr de manera desigual en una placa de TLC. Esto puede ocurrir si la placa se colocó en la cámara con una ligera inclinación, si el eluyente salpicó sobre la placa durante la colocación en la cámara, o si la cámara fue sometida a presión durante la elución. En los casos en que el frente sea dramáticamente diferente de una posición a la otra, el frente debe medirse para cada carril de la placa (si se calcula una\(R_f\)) en lugar de solo una vez.

Fabricación de Spotters de TLC Capilar

Aunque se pueden adquirir los spotters capilares para TLC, algunos químicos prefieren crear las suyas propias estirando pipetas Pasteur (Figura 2.28). Para hacer un spotter, sostenga una pipeta por los bordes mientras usa guantes gruesos y coloque la mitad de la pipeta en la llama de un quemador Meker grande (Figura 2.28a). Caliente la pipeta hasta que el vidrio se vuelva bastante flexible (el vidrio de borosilicato se ablanda en\(820^\text{o} \text{C}\),\(^5\) así que esto llevará algún tiempo). Solo gira, pero no estire la pipeta en absoluto mientras la pipeta está en la llama. Después retire la pipeta de la llama e inmediata y rápidamente tire de la pipeta a la longitud de un brazo. Las secciones delgadas se pueden romper en segmentos de 6-12 pulgadas y usarse para TLC.

Figura 2.28: a) Calentamiento de una pipeta en un quemador Meker, b+c) Estiramiento de la pipeta.

Cuaderno Registro de TLC

Algunos químicos escanean, fotografían o registran electrónicamente sus placas TLC desarrolladas, pero es mucho más común copiar una imagen de una placa TLC a mano en un cuaderno de laboratorio. Es importante copiar una placa TLC “a escala”, es decir, las dimensiones deben ser las mismas en el cuaderno que en la actualidad.

Para lograr esto, la placa TLC se puede colocar encima de una página de cuaderno y crear una representación junto a ella (Figura 2.29c). La parte posterior de la placa TLC debe limpiarse previamente o de lo contrario los reactivos de tinción pueden degradar el papel. Es importante copiar la placa TLC con la mayor precisión posible, dibujando las manchas exactamente como aparecen, incluso si son rayadas o blobby. Todos los spots que se ven en un carril deben ser registrados, aunque estén desmayados. Un buen registro significa registrar todas las observaciones, incluso si se desconoce la importancia; un punto débil e inesperado puede llegar a ser relevante en un momento posterior.

Figura 2.29: Registro de una placa TLC en un cuaderno de laboratorio: a) Placa bajo luz UV, b) Placa teñida con p-anisaldehído, tal como apareció directamente después del calentamiento, c) Copia de la TLC en el cuaderno, d) Registro final en el cuaderno.

Se deben hacer varias otras anotaciones junto con el boceto de la placa TLC (Figura 2.29d). Se debe registrar el sistema solvente y la identidad de lo que se moteó en cada carril. Para cada mancha, se\(R_f\) debe calcular una (a algunos químicos les gusta escribir las mediciones en la placa TLC; ver la placa en la Figura 2.29d) junto con la notación de la actividad UV y el color de la mancha. Si una mancha cambia de apariencia con el tiempo, ya que la mancha naranja en la Figura 2.29b se desvaneció a verde claro con el tiempo (Figura 2.29d), se debe registrar la apariencia inicial.

Figura 2.30: Alumnos de química orgánica haciendo entradas en sus cuadernos.

\(^3\)El grafito a lápiz no viajará con el eluyente, pero la tinta de pluma lo haría.

\(^4\)J. Sherman y B. Fried, Manual de Cromatografía en Capa Fina, 1991.

\(^5\)G. L. Weissler, Vacuum Physics and Technology, 2\(^\text{nd}\) edición, 1979, p. 315.