2.4A: Columnas a Macroscale

Generalidades Procesales

Los mismos principios subyacentes de la cromatografía en capa fina (TLC) se aplican a la cromatografía en columna. De hecho, siempre se realiza una TLC antes de realizar una columna para evaluar la situación y determinar la relación adecuada de disolventes. Para obtener una buena separación, es ideal si el componente deseado tiene \(R_f\)alrededor de 0.35 y está separado de otros componentes por al menos 0.2\(R_f\) unidades. \(^8\)Si las manchas a separar son muy cercanas (si la diferencia en\(R_f\) es < 0.2), lo mejor es que la mitad de las manchas tenga una\(R_f\) de 0.35. Un\(R_f\) cerca de 0.35 es ideal porque es lo suficientemente lento como para que pueda ocurrir un equilibrio de fase estacionario-móvil, pero lo suficientemente rápido como para minimizar el ensanchamiento de banda por difusión.

Existen algunas variables que no son aplicables a TLC, pero que afectan la separación de componentes en la cromatografía en columna. Estos incluyen el diámetro de la columna, la cantidad de adsorbente utilizado y el caudal del disolvente. En el Cuadro 2.5 se resumen las recomendaciones de variables con base en el tamaño de la muestra y el grado de separación entre componentes. En todos los escenarios, las columnas deben prepararse entre 5-6 pulgadas de alto.

Cuadro 2.5: Resumen de valores recomendados para cromatografía en columna. \(^9\)

Diámetro de la columna\(\left( \text{mm} \right)\)	Volumen de eluyente\(\left( \text{mL} \right)\)	Tamaño de la muestra\(\left( \text{mg} \right)\) Si\(\Delta R_f\) > 0.2	Tamaño de la muestra\(\left( \text{mg} \right)\) Si\(\Delta R_f\) > 0.1	Tamaño típico de la fracción\(\left( \text{mL} \right)\)
\ (\ left (\ text {mm}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">10	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">100	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.2">0.2" style="vertical-align: middle; ">100	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.1">0.1" style="vertical-align: middle; ">40	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">5
\ (\ left (\ text {mm}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">20	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">200	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.2">0.2" style="vertical-align: middle; ">400	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.1">0.1" style="vertical-align: middle; ">160	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">10
\ (\ left (\ text {mm}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">30	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">400	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.2">0.2" style="vertical-align: middle; ">900	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.1">0.1" style="vertical-align: middle; ">360	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">20
\ (\ left (\ text {mm}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">40	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">600	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.2">0.2" style="vertical-align: middle; ">1600	\ (\ left (\ text {mg}\ right)\) If\(\Delta R_f\) > 0.1">0.1" style="vertical-align: middle; ">600	\ (\ left (\ text {mL}\ right)\)” style="vertical-align:middle; ">30

Por ejemplo, una columna de una pulgada de diámetro (\(1 \: \text{in}\)is\(25.4 \: \text{mm}\)) debería poder purificar alrededor\(400 \: \text{mg}\) del material si la separación es buena (\(\Delta R_f\)> 0.2, tercera columna en la Tabla 2.5), o alrededor\(160 \: \text{mg}\) si la separación es difícil (\(\Delta R_f\)> 0.1). La columna debe poder prepararse y eluirse usando alrededor\(200 \: \text{mL}\) de solvente, y las fracciones se pueden recolectar con aproximadamente\(10 \: \text{mL}\) de solución cada una. \(^9\)

Hay múltiples variaciones sobre cómo ejecutar físicamente una columna, y su instructor puede preferir un método determinado. Una gran diferencia en los métodos es cómo se prepara la columna. En el método de “empaquetamiento en seco”, se agrega sílice seca o alúmina directamente a una columna, y se deja que el disolvente gotee en porciones, luego con presión. En el método de “empaque húmedo”, la columna se llena primero con disolvente, luego se agita ligeramente sílice seca o alúmina, luego se rellena con presión. En el método de “suspensión”, se agrega disolvente a la sílice o alúmina en un matraz Erlenmeyer, se vierte sobre la columna como un material fangoso, luego se rellena con presión.

Es importante saber que el calor se libera cuando se agrega disolvente a sílice o alúmina (tienen un calor exotérmico de solvatación). El método de la suspensión se presenta en esta sección, con la razón principal de que permite que este paso exotérmico ocurra en un matraz Erlenmeyer en lugar de en la columna. Si se libera calor durante el empaquetamiento de la columna, puede generar burbujas a partir de la ebullición del disolvente. Estos pueden interferir con la separación de la columna si no se eliminan adecuadamente, y pueden agrietar el material adsorbente en la columna.

Procedimientos paso a paso

Figura 2.51: a) TLC de mezcla de ferroceno/acetilferroceno, b) Cromatografía en columna.

La columna representada en esta sección muestra la purificación de una\(0.20 \: \text{g}\) muestra que contiene una mezcla de ferroceno y acetilferroceno (TLC en bruto está en la Figura 2.51a). Se colectaron\(8 \: \text{mL}\) fracciones aproximadamente en pequeños tubos\(400 \: \text{mL}\) de ensayo y se utilizó aproximadamente eluyente.

Figura 2.52: a) Placa TLC de mezcla de ferroceno/acetilferroceno bruto antes de la elución, b) Después de la elución, c) Columna con frita, d) Columna con algodón acuñado en el fondo, e) Columna carente de la cuña de algodón (necesitaría insertarse antes de su uso).

Ejecutar un TLC

1. Ejecutar una TLC de la muestra a purificar (Figuras 2.52 a+b) para determinar el disolvente apropiado para la cromatografía. El componente deseado debe tener \(R_f\)alrededor de 0.35 e idealmente debe estar separado de todos los demás puntos por al menos 0.2\(R_f\) unidades.
2. Preparar un lote de eluyente que dé el\(R_f\) valor adecuado. La cantidad preparada depende de la cantidad de muestra, el tamaño de la columna y si se planea o no cambiar la composición del disolvente a mitad de camino. (Consulte el Cuadro 2.5 para las pautas y las series eluotrópicas para las tendencias en “poder solvente”).

Preparar la columna empaquetada

3. Obtener una columna apropiada (ver Tabla 2.5), y asegúrese de que hay algo cerca de la llave de paso que permita que el líquido pase a través, pero no sólido. Las columnas pueden tener un disco sinterizado (también conocido como “frita”, Figura 2.52c), o un tapón de algodón o lana de vidrio restante del usuario anterior (Figura 2.52d). Si no hay disco o tapón presente (Figura 2.52e), acuñe un pequeño fajo de algodón o lana de vidrio en el fondo de la columna usando una varilla larga.

Figura 2.53: a) Verter en sílice a 5-6" de altura en la campana de humos, b) Verter la sílice en un matraz Erlenmeyer, c+d) Elaboración de una suspensión.

4. Asegure su columna perfectamente verticalmente a un soporte de anillo o celosía, sujetándola con abrazaderas de tres dedos en dos ubicaciones. En la campana extractora, vierta gel de sílice o adsorbente de alúmina en la columna a entre 5-6 pulgadas de alto (Figura 2.53a).
   Nota de seguridad: La sílice en polvo y la alúmina son irritantes pulmonares, y siempre deben manejarse con cuidado en una campana extractora. El polvo derramado debe eliminarse fregándolo con una toalla de papel húmeda (si está húmeda, las partículas finas son menos dispersivas).
5. En la campana extractora, verter el adsorbente medido en la columna en un matraz Erlenmeyer (Figura 2.53b), luego agregar algún eluyente (Figura 2.53c). Hacer una suspensión suelta arremolinando y agitando con una varilla agitadora de vidrio (Figura 2.53d) hasta que todo el adsorbente esté completamente húmedo, se liberen burbujas de gas y la consistencia sea algo espesa pero vertible.

Figura 2.54: a) Verter la suspensión en la columna, b) Enjuagar el matraz, c) Adsorbente adherido a los lados de la columna, d) Aclarar el adsorbente aferrado.

6. Coloque un vaso de precipitados o matraz Erlenmeyer debajo de la columna sujeta y abra la llave de paso. En un movimiento rápido, gire y vierta la suspensión de sílice o alúmina en la columna usando un embudo de boca grande (Figura 2.54a). Inmediatamente use más eluyente para enjuagar la suspensión residual del matraz Erlenmeyer (Figura 2.54b) y sobre la columna.
7. Enjuague inmediatamente cualquier sílice o alúmina de los lados del depósito de la columna usando eluyente y un movimiento de remolino de una pipeta Pasteur (Figuras 2.54 c+d). Si se deja secar, el adsorbente se adhiere al vidrio y no se enjuaga fácilmente.

Figura 2.55: a) Aplastar la columna para eliminar las burbujas de aire, b) Aplicar presión de aire, c) Agregar arena, d) Enjuagar la arena por los lados.

8. Empuje la columna firmemente usando un anillo de corcho o sus nudillos (Figura 2.55a) para desalojar cualquier burbuja de aire en la columna (lo que podría causar una mala separación o agrietamiento del adsorbente en la columna), y para promover una deposición uniforme del adsorbente.
9. Aplicar una presión de aire suave en la parte superior de la columna (Figura 2.55b) para comprimirla, deteniéndose cuando el nivel del eluyente está\(1 \: \text{cm}\) desde la parte superior de la columna. Si se usa un adaptador en T con la línea de aire como en la Figura 2.55b, se puede lograr un control fino del flujo de aire ajustando la abrazadera de pellizco en la tubería de goma.
   
   A lo largo de todo el proceso de elución, mantener húmeda la columna blanca de adsorbente, con el nivel de eluyente por encima de la parte superior de la sílice o alúmina.
   
   Rompe suavemente el sello para dejar de aplicar presión y cierre la llave de paso para evitar que el líquido gotee más.
10. Agrega una fina capa de arena (Figura 2.55c), aproximadamente\(0.5 \: \text{cm}\) alta. Enjuague los lados de la columna con eluyente usando un movimiento de remolino para desalojar la arena de los lados del vidrio (Figura 2.55d). Abra la llave de paso y permita que el líquido gotee hasta que el líquido esté justo por encima de la capa de arena. Aplique presión de aire si el goteo es demasiado lento.

Agregar la muestra

Una vez aplicada la muestra a la columna, hay una carrera contra el tiempo, ya que la difusión comenzará a ampliar el material. No se debe aplicar una muestra hasta que esté listo para completar la columna inmediatamente y en su totalidad. ¡Este proceso puede tardar entre 15 y 90 minutos! Si se usan tubos de ensayo para recolectar fracciones, los tubos de ensayo deben colocarse en una gradilla antes de agregar la muestra, y la altura de la columna debe ajustarse para que la gradilla de tubos de ensayo pueda deslizarse por debajo.

Figura 2.56: a) Disolver un sólido con una pequeña cantidad de diclorometano, b) Aplicar la muestra, c) Enjuagar la muestra en su matraz, d) Aplicar presión para empujar la muestra sobre la columna justo más allá de la capa de arena.

11. Si la muestra cruda es un líquido, úsela directamente (continúe con el paso 13).
12. Si la muestra en bruto es un sólido, haga una de las siguientes cosas:
    1. Situación ideal: disolver el sólido en la cantidad mínima del eluyente (unos pocos\(\text{mL}\) como máximo).
    2. Si el sólido no es particularmente soluble, o no se disuelve en unos pocos\(\text{mL}\) del eluyente, disuelva en la cantidad mínima de diclorometano (pocos como máximo, Figura\(\text{mL}\) 2.56a).
    3. Si el sólido es insoluble en el eluyente, también es posible un procedimiento alternativo. Disolver el sólido en un matraz de fondo redondo usando algunos disolventes\(\text{mL}\) de bajo punto de ebullición (por ejemplo, diclorometano o acetona). Agregar al matraz aproximadamente\(1 \: \text{g}\) de sílice o alúmina, luego retirar el disolvente en el evaporador rotatorio para dejar un sólido que contiene la muestra depositada sobre el adsorbente. Con una pulgada de eluyente descansando encima de la columna empaquetada (omita agregar la capa de arena si se usa este método), vierta la muestra adsorbida de sílice sobre la columna usando un embudo de boca ancha. Si algún polvo se adhiere al vaso, enjuáguelo con más eluyente (continúe con el paso 15.)
13. Agrega delicadamente la muestra a la columna vía pipeta, goteando el líquido o solución directamente sobre la arena con la punta de la pipeta lo más cerca que puedas manejar, no por los lados (Figura 2.56b). Tenga cuidado de no arrojar líquido a la fuerza de tal manera que se provoquen indentaciones en la columna de arena o sílice/alúmina.
14. Enjuague el recipiente de muestra con un poco de disolvente (o diclorometano si se usa, Figura 2.56c) y agregue el enjuague a la columna usando la misma pipeta (para enjuagar también la pipeta).
15. Abra la llave de paso y deje que el líquido gotee hasta que la muestra esté justo más allá de la capa de arena (Figura 2.56d) y dentro del área blanca de la columna (aplique presión de aire si esto toma más de 20 segundos).
16. Enjuague suavemente los lados de la columna con un movimiento de remolino usando 1-2 pipetas llenas de eluyente para enjuagar cualquier muestra salpicada. Nuevamente, permita que el líquido gotee (o aplique presión de aire) hasta que la muestra sea empujada hacia el adsorbente blanco.
    
    Repita el paso de enjuague hasta que se sienta seguro de que toda la muestra está depositada sobre el adsorbente. Si parte de la muestra aún se encuentra en la capa de arena, puede disolverse en el eluyente cuando se agrega más disolvente, lo que lleva a una pérdida de rendimiento. Si el compuesto está coloreado, el enjuague debe ser completamente transparente.

Figura 2.57: a+b) Llenado del reservorio de disolvente, c+d) Eluyendo la columna.

Rellenar con Eluyente y Eluir la Columna

17. Añadir delicadamente más eluyente vía pipeta (Figura 2.57a), arremolinándose por los lados, y luego cuando la capa de arena ya no se alterara con las adiciones, vierta cuidadosamente cantidades mayores (Figura 2.57b) del eluyente preparado para llenar el reservorio (o llenar con tanto como sea necesario). El eluyente limpio recolectado durante el empaque de la columna puede ser reutilizado.
18. Use presión de aire para eluir suave y constantemente la muestra a través de la columna (Figuras 2.57 c+d). Cuantas más veces se inicie y se detenga la presión, más probable es que se agriete la columna. Lo mejor es que la presión se mantenga suave y constante todo el tiempo.
    
    La tasa óptima de goteo durante la elución depende del tamaño de la columna. El flujo ideal de eluyente es cuando el disolvente en la sección cilíndrica de la columna por encima del adsorbente cae a una velocidad de 2.0 pulgadas por minuto. \(^{10}\)Por lo tanto, la tasa de goteo debe ser más lenta con una columna estrecha en comparación con una columna más ancha.
    
    La tasa de goteo para una columna de una pulgada debe ser donde las gotas individuales apenas puedan distinguirse. Una corriente de líquido que vierte la llave de paso con este tamaño de columna es un poco demasiado rápida.

Figura 2.58: a-c) Recolección de fracciones, d) Autor ejecutando una columna.

Recoger fracciones

19. Inmediatamente comience a recoger el líquido eluyente en tubos de ensayo en una gradilla (Figura 2.58a). Consulte el Cuadro 2.5 para obtener recomendaciones sobre los volúmenes a recolectar en cada tubo de ensayo.
20. Cuando se llene el primer tubo de ensayo, o si se ha recogido cierta altura de líquido según lo recomendado por su instructor o la Tabla 2.5, mueva la rejilla para comenzar a recogerla en un tubo diferente (Figuras 2.58 b+c). Llene y mantenga los tubos en orden en el rack.
    
    Estos diferentes tubos se denominan "fracciones”. El objetivo de una columna es recolectar fracciones lo suficientemente pequeñas como para que la mayoría (o algunas) fracciones contengan material puro. Si la separación de la mezcla es difícil (si el\(\Delta R_f\) de los componentes es bajo), puede ser mejor recolectar pequeñas fracciones (por ejemplo, tubos medio llenos).

Figura 2.59: a-c) Enjuagar el material salpicado sobre la punta de la columna, d) Estudiantes corriendo una columna.

21. A medida que el líquido drena de la columna, a menudo salpica sobre el exterior de la punta de la columna, y cuando el disolvente se evapora es posible que vea un anillo de material en la punta (verá un anillo de sólido si el componente es un sólido como en la Figura 2.59b, o gotitas oleosas si el componente es un líquido). Si los componentes están coloreados, la punta de la columna debe enjuagarse (Figura 2.59c) cuando aparece como si un componente se hubiera eluido completamente y antes de que el otro componente se acerque.
22. Periódicamente vigile el nivel del eluyente y rellene antes de que caiga por debajo de la capa de arena.

Figura 2.60: a) Elución, b) Adición de acetato de etilo para aumentar la polaridad del disolvente, c) El nivel de disolvente se acerca a la capa de arena, d) Relleno.

Posiblemente aumentar la polaridad del solvente

23. Se puede usar un eluyente a lo largo de toda la columna, especialmente si los componentes a separar tienen\(R_f\) valores similares. Sin embargo, si los componentes tienen\(R_f\) valores muy diferentes, la polaridad del disolvente puede aumentarse después de que un componente haya eluido de la columna (Figura 2.60a).
    
    El aumento de la polaridad del solvente hará que los componentes viajen “más rápido”. Hay varias razones por las que se desea una elución más rápida. Primero, si un componente ya ha salido de la columna, la columna ya ha hecho su trabajo con separación, por lo que acelerar el proceso no afectará la pureza de las fracciones recolectadas. En segundo lugar, cuanto más tiempo se tarda en correr una columna, más anchas serán las bandas componentes (debido a la difusión), y recoger una banda ancha de material utilizará (y desperdiciará) mucho disolvente.
    
    El Cuadro 2.6 contiene una lista parcial de las series eluotrópicas, una lista de solventes comunes clasificados según su “poder disolvente” en cromatografía de fase normal. El solvente más polar provoca el aumento más dramático en\(R_f\).

Cuadro 2.6: Serie eluotrópica.

Serie Eluotrópica (de menor a más polar)
Éter de petróleo/hexanos
diclorometano
Éter dietílico
Acetato de etilo
Acetona
Metanol

24. Para aumentar la polaridad del disolvente, el disolvente polar se puede gotear directamente en el eluyente en el depósito de la columna (Figura 2.60b). Por ejemplo, si se usa una mezcla de hexanos:acetato de etilo, la adición de acetato de etilo puro al eluyente actualmente en el reservorio aumentaría su polaridad. Si el nivel de eluyente se está agotando, se podría preparar una solución que contenga un mayor porcentaje del componente más polar. Por ejemplo, si la columna utilizó primero una mezcla 4:1 de hexanos:acetato de etilo, usar una mezcla 1:1 sería un disolvente más polar.
25. Eluir la columna con el disolvente más polar como antes, y recuerde siempre observar el nivel del eluyente, y rellenar (Figura 2.60d) antes de que caiga por debajo de la capa de arena.

Figura 2.61: a) Placa de TLC original, b) Fracciones recogidas por la columna, c) Manchado de fracciones en una placa de TLC, d) Una placa de TLC visualizada de muestras de cada fracción.

Encontrar y concentrar el componente deseado

26. Al encontrar el componente deseado en las fracciones del tubo de ensayo, es útil comprender la relación entre\(R_f\) y el orden de elución en la cromatografía en columna.
    
    En la cromatografía en columna, la muestra se deposita en la parte superior de la columna y se eluye hacia abajo, mientras que en la cromatografía en capa fina la muestra se mancha en el fondo de la placa y se eluye hacia arriba. Por lo tanto, una columna puede pensarse como una placa TLC invertida. Un compuesto con\(R_f\) corridas más altas “más rápido”, lo que significa que terminará más alto en una placa de TLC, y se recolectará primero con una columna.
    
    En la columna que se muestra en esta sección, el componente con el inferior\(R_f\) (naranja en la placa TLC en la Figura 2.61a), es el componente recogido segundo de la columna.
27. Primero determine qué tubos de ensayo contienen compuesto disuelto.
    1. Colocar una muestra de cada fracción en una placa TLC marcada con números de fracción correspondientes al orden en que fueron recolectadas (Figura 2.61c). Puede ser mejor manchar cada muestra 2-3 veces una encima de la otra en caso de que las fracciones estén diluidas.
    2. Si se han recolectado muchas fracciones, lo que le hace dudar en tomar muestras de cada fracción, un método para identificar fracciones incoloras que pueden contener compuesto es buscar un indicio de residuo en la parte superior de los tubos de ensayo. Después de la evaporación, a veces se deja un residuo sólido (Figura 2.62) o gotitas oleosas en la parte superior del tubo de ensayo, haciendo evidente que esas fracciones contienen más que solo disolvente. Muestrear todas las fracciones cercanas a los tubos que contienen residuo visible.

Figura 2.62: Anillo de sólido visto en llantas de tubo después de la evaporación.

3. Visualice la placa de TLC manchada usando luz UV y/o una mancha para determinar qué fracciones contienen compuesto (Figura 2.61d).

Figura 2.63: a) Placas de TLC eluidas de fracciones que contienen posible compuesto, b) Combinar fracciones, c) Enjuagar un tubo de fracción.

28. Ejecutar una TLC de todas las fracciones que contienen compuesto, manchando hasta cinco muestras por placa TLC de 1 pulgada de ancho. Se pueden usar placas TLC más anchas para este propósito si están disponibles.
29. Identificar el compuesto con el deseado\(R_f\) por comparación con la placa TLC bruta original. Elija retener las fracciones que tengan el compuesto deseado en forma pura, como lo demuestra la placa TLC eluida. Por ejemplo, si\(R_f\) se desea el compuesto con el mayor en la Figura 2.63a, deben mantenerse las fracciones 6-10.
30. Combine las fracciones puras en un matraz de fondo redondo de tamaño apropiado (no más de medio lleno, Figura 2.63b). Enjuague cada tubo de ensayo con una pequeña cantidad de eluyente (u otro disolvente si la solubilidad es un problema), y agregue el enjuague al matraz de fondo redondo (Figura 2.63c).
31. Evaporar el disolvente en el evaporador rotatorio para dejar el compuesto purificado en el matraz.

Figura 2.64: a) Usar presión de aire para secar la columna, b) Permitir que la columna se seque boca abajo, c) Recogida de la sílice residual.

Limpiar la columna

32. Para secar la columna, aplique presión de aire para drenar la mayor parte del eluyente de la columna a un contenedor de desechos. Luego seque más la columna usando uno de estos métodos:
    1. Deja conectado una suave corriente de aire que corre a través de la columna para secarla aún más a medida que limpias otras cosas (Figura 2.64a).
    2. Sujete la columna boca abajo sobre un vaso de precipitados de gran tamaño en la campana extractora, para que el adsorbente caiga cuando se haya secado (Figura 2.64b). Esto llevará mucho tiempo (hasta el siguiente periodo de clase), pero es una opción.
33. Cuando está seco, el adsorbente se puede verter fuera de la columna en un contenedor de desechos en la campana extractora (Figura 2.64c).
    
    Nota de seguridad: Los adsorbentes en polvo son irritantes pulmonares, y su peligro se agrava si la columna contiene compuestos residuales que ahora pueden llegar a tus pulmones. El vertido de polvos de sílice o alúmina siempre se debe hacer en la campana extractora.
34. Cuando la mayor parte del adsorbente se haya recogido en un contenedor de desechos, use agua para enjuagar cualquier sólido residual en el fregadero, y luego enjuague la columna con acetona en un vaso de precipitados de desechos. Limpie aún más la columna con agua y jabón y seque con las partes de la llave de paso separadas.

Resumen de Columna Macroscale

Cuadro 2.7: Resumen procesal para cromatografía en columna a macroscale.

Asegúrese de que haya un tapón de frita o algodón en la parte inferior de la columna. Llene la columna con sílice o alúmina hasta 5-6 pulgadas en la campana de humos.	Vierte el adsorbente en un matraz Erlenmeyer y agrega eluyente para hacer una suspensión vertible. El eluyente debe dar el componente\(R_f\) deseado a 0.35 por TLC.	Vierte la suspensión y enjuaga inmediatamente los lados de la columna con eluyente y una pipeta. Apretar la columna para eliminar las burbujas de aire. Use presión de aire para empacar la columna. Mantenlo perfectamente vertical.	Añadir\(0.5 \: \text{cm}\) de arena. Enjuaga la arena de los lados cuidadosamente con un movimiento de remolino. No interrumpa la superficie superior de la sílice o alúmina con el enjuague.
Ajuste el nivel de eluyente a la capa de arena y luego agregue la muestra (líquido puro\(\ce{CH_2Cl_2}\), disuelto o sólido adsorbido sobre una porción de sílice). Enjuague los lados y use presión de aire para forzar el eluyente hacia abajo sobre la capa de sílice/alúmina.	Llene el depósito con eluyente (cuidadosamente para no interrumpir la superficie superior). Use presión de aire constante para eluir la columna. Recoger fracciones en tubos de ensayo en una gradilla (mantener en orden).	Enjuague la punta de la columna si un componente ha terminado de salir de la columna. Posiblemente aumentar la polaridad del eluyente para hacer que los componentes eluyan más rápido. Nunca permita que el eluyente caiga por debajo de la parte superior de la columna adsorbente.	Use TLC para determinar la pureza de las fracciones y combinar las fracciones apropiadas. Retire el disolvente con el evaporador rotatorio.

Solución de problemas

La Pipeta se Rompió en la Columna

Es bastante común romper la punta de una pipeta Pasteur mientras se enjuaga la columna, que a menudo cae y se acuña en la delicada columna. Desafortunadamente, una pipeta rota en una columna puede causar problemas con la separación de componentes.

Por ejemplo, la Figura 2.65 muestra el efecto de una pipeta rota sobre la separación de dos componentes. Una pipeta rota está incrustada en la columna y es la línea casi vertical de naranja que se ve entre las dos bandas de la columna. Dado que el equilibrio de fase estacionario-móvil no ocurre en la superficie de vidrio de la pipeta, los compuestos fluyen rápidamente y se mueven más rápido de lo que deberían en función de su\(R_f\). La línea vertical naranja es el componente superior que drena en la banda del componente inferior, contaminándolo.

Figura 2.65: Efecto de una pipeta rota en una columna.

Si una pipeta rota perfora la columna, y aún no se ha aplicado la arena o la muestra, intente retirar la pipeta con pinzas largas. Después de retirarla, aprieta vigorosamente la columna para empacarla nuevamente y continuar con la columna. Si la pipeta no se puede quitar con fórceps, puede considerar rehacer la columna.

Si ya se ha aplicado la arena, la extracción de la pipeta y el empuje de la columna a menudo arruinarán la superficie horizontal del adsorbente, por lo que será necesario volver a empaquetar la columna.

Si ya se aplicó la muestra, no hay nada que hacer más que continuar y esperar lo mejor. Si la columna da como resultado una separación sin éxito, todas las fracciones que contienen el compuesto de interés pueden combinarse, evaporarse el disolvente por el evaporador rotatorio y se puede intentar otro método de purificación (o una segunda columna).

Se ven burbujas de aire en la columna

Al igual que una pipeta rota, una burbuja de aire es un bolsillo vacío donde no ocurre el equilibrio de fase estacionario-móvil, por lo que los componentes se mueven más rápido alrededor de una burbuja de aire de lo que deberían. Esto puede llevar a bandas de elución desiguales, lo que puede provocar solapamiento si la separación de la mezcla es difícil (si los componentes tienen\(R_f\) valores muy cercanos, como en la Figura 2.66).

Figura 2.66: Efecto de una burbuja de aire sobre la separación en una columna.

Si se observan burbujas de aire en la columna y aún no se ha aplicado la arena o muestra, dale a la columna un buen empuje durante el empaque para eliminar todas las burbujas de aire. Consulta a tu instructor si las burbujas no se mueven ya que es posible que te estés acercando a la tarea con demasiada delicadeza. Si ya se ha aplicado la arena o muestra, lo mejor es dejar la columna tal cual y esperar que las burbujas de aire no afecten la separación.

Las bandas están eluyendo de manera desigual

Si los componentes de una mezcla están coloreados, puede ser obvio cuando las bandas se eluyen de manera torcida. Esto probablemente se deba a que la columna está sujeta en una ligera diagonal.

Si la columna se sujeta de manera inclinada, los componentes se desplazarán de manera inclinada (Figura 2.67). Esto puede causar problemas de separación si los componentes tienen un similar\(R_f\).

Figura 2.67: Efecto de una columna torcida sobre la separación.

No hay forma de solucionar este problema a mitad de una columna, pero si los componentes tienen\(R_f\) valores muy diferentes, las bandas inclinadas pueden no tener efecto en la separación. En el futuro, asegúrese de verificar que la columna esté perfectamente vertical tanto en la dirección de lado a lado como de adelante hacia atrás.

\(^8\)W.C. Still, M. Kahn, A. Mitra, J. Org. Chem., Vol. 43, Núm. 14, 1978.

\(^9\)Un tubo de ensayo pequeño típico\(\left( 13 x 100 \: \text{mm} \right)\) tiene una capacidad de\(9 \: \text{mL}\), y un tubo de ensayo medio típico\(\left( 18 x 150 \: \text{mm} \right)\) tiene una capacidad de\(27 \: \text{mL}\).

\(^{10}\)W.C. Still, M. Kahn, A. Mitra, J. Org. Chem. , Vol. 43, Núm. 14, 1978.