2.4B: Columnas a Microescala (Pipeta)

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Una columna a macroescala es demasiado grande para cantidades muy pequeñas de material\(\left( < 20 \: \text{mg} \right)\). En su lugar, se puede construir una columna usando una pipeta Pasteur desechable.

Para obtener una buena separación, es ideal si el componente deseado tiene \(R_f\)alrededor de 0.35 y está separado de otros componentes por al menos 0.2\(R_f\) unidades. \(^{11}\)Si las manchas a separar son muy cercanas (< 0.2\(\Delta R_f\)), lo mejor es que la mitad de las manchas tenga una\(R_f\) de 0.35. Un\(R_f\) cerca de 0.35 es ideal porque es lo suficientemente lento como para que pueda ocurrir un equilibrio de fase estacionario-móvil, pero lo suficientemente rápido como para minimizar el ensanchamiento de banda por difusión.

Procedimientos paso a paso

Figura 2.68: a) Placa TLC de colorante púrpura, b) Elución con una columna de pipeta.

La columna que se muestra en esta sección muestra la purificación de una gota de tinte alimentario morado diluido (hecho de 1 gota de tinte rojo, 1 gota de tinte azul y 15 gotas de agua). El colorante se separa lo mejor posible en sus tres componentes: azul, rojo y rosa (como se ve en la placa TLC de la Figura 2.68a). Se utiliza una columna de 2.5 “de gel de sílice y se eluye con una solución hecha a partir de una relación de volumen 1:3:1 de:1-pentanol:etanol\(6 \: \text{M} \: \ce{NH_4OH}\).

Figura 2.69: a) Tinte púrpura manchado en la línea base de una placa de TLC, b) después de la elución, c-e) Inserción de algodón en la punta de la pipeta.

Ejecutar una TLC de la muestra a purificar (Figuras 2.69 a+b) para determinar el disolvente apropiado para la cromatografía. El componente deseado debe tener \(R_f\)alrededor de 0.35.

Preparar la columna seca

Use una varilla o colgador de metal (Figura 2.69d) para meter un poco de algodón o lana de vidrio en el extremo estrecho de una pipeta Pasteur de tallo corto. El algodón debe ser moderadamente apretado para que el líquido pueda gotear, pero no sólido.

Figura 2.70: a) Recogida de gel de sílice en la columna de pipeta, b+c) Usando una pipeta como embudo, d) Recogida de arena, e) Columna seca completa.

Coloque sílice o alúmina en el extremo ancho de la columna de pipeta (Figura 2.70a), luego invierta y levante la columna para que el polvo caiga al fondo. Continúe usando este método de recolección para llenar la columna de pipeta a 2 - 2.5 pulgadas de alto con sílice o alúmina (esta cantidad puede alterarse dependiendo de la cantidad de muestra).

Alternativamente, coloque el adsorbente en el extremo ancho de una pipeta nueva y úselo como embudo para suministrar adsorbente a través de la punta estrecha y dentro de la columna de pipeta asegurada a un soporte de anillo con una abrazadera de tres dedos (Figuras 2.70 a—c).

Nota de seguridad: Como la sílice y la alúmina son polvos finos e irritantes pulmonares, asegúrese de trabajar en una campana de humos cuando manipule sílice o alúmina. También golpee la pipeta después de sacarla con pala para desalojar el adsorbente en el exterior de la pipeta (para que no se derrame cuando esté vertical).
Sujete suavemente la columna de pipeta a un soporte de anillo o celosía con una abrazadera de tres dedos (nota: ¡son frágiles!) y golpecifíquelo para asegurarse de que la sílice/alúmina esté sedimentada y que el borde superior esté horizontal.
Agregue aproximadamente arena encima\(0.5 \: \text{cm}\) de la capa de sílice/alúmina. Si usa arena muy fina, use otra pipeta para que actúe como embudo, como se describe en el paso 3. Para arena gruesa, use una pala pequeña o el extremo ancho de otra pipeta para ayudar en su entrega (Figura 2.70d). Una columna de pipeta completa se encuentra en la Figura 2.70e.

Figura 2.71: a) Agregar eluyente, b-d) Aplicar presión de bulbo y romper correctamente el sello, e) Eluyendo la columna.

Mojar la columna

Coloque un tubo de ensayo apoyado en un pequeño vaso de precipitados debajo de la columna. Añadir un chorro lleno del eluyente apropiado (previamente determinado por TLC en el Paso 1), suavemente por encima de la capa de arena de la columna de pipeta (Figura 2.71a).
Use una bombilla de pipeta (o bulbo cuentagotas) para aplicar una presión de aire suave y empujar el eluyente a través de la columna (Figura 2.71b), deteniéndose cuando el nivel de líquido está en la capa de arena. A lo largo de todo el proceso de elución, mantenga esta sección de columna blanca húmeda con eluyente.

Para aplicar presión de aire usando una bombilla de pipeta, cree una fuerte conexión entre la columna y la bombilla, y luego apriete la bombilla. Es importante al liberar la presión romper primero el sello mientras aún mantiene la mano apretada (Figura 2.71c) y ENTONCES suelte la mano (Figura 2.71d). Si sueltas tu mano mientras aún estás conectado a la columna, la bombilla creará una succión que puede atraer violentamente líquido hacia la bombilla e interrumpir la columna.
Agregue más eluyente si es necesario, y use presión de bulbo hasta que toda la columna esté saturada con eluyente (Figura 2.71e), y el nivel del eluyente esté en la capa de arena.

Figura 2.72: a) Adición de muestra, b) Aplicación de presión, c) Tinte empujado sobre el adsorbente, d) Relleno con eluyente, e) Eluyendo.

Agregar la muestra

Use una pipeta para agregar toda la muestra a la capa de arena. Si la muestra es un líquido, agréguela directamente. Si es un sólido, disolverlo en la menor cantidad de disolvente posible, preferiblemente el eluyente. Si el sólido no es soluble en el eluyente, use la cantidad mínima de diclorometano. Coloque la punta de la pipeta cerca de la capa de arena y agregue la muestra cuidadosamente, tratando de no salpicar compuesto en los lados (Figura 2.72a).
Enjuague el recipiente original con un poco de disolvente y agregue el enjuague a la columna usando la misma pipeta (para enjuagar también la pipeta).
Aplicar presión con el bulbo para forzar la muestra justo más allá de la capa de arena (Figuras 2.72 b+c).
Agregar más eluyente (aproximadamente\(0.5 \: \text{cm}\) alto) para enjuagar los lados de la columna (Figura 2.72d). Nuevamente use presión de bulbo para forzar el tinte sobre el adsorbente (Figura 2.72e), y luego llenar la pipeta por encima de la capa de arena lo más alto posible con eluyente.

Figura 2.73: a) Eluyendo, b) Recogiendo la fracción rosa, c) Cambio del tubo de recolección, d) Almacenamiento de fracciones en una gradilla, e) Recogida de la fracción roja.

Eluir la Columna y Recoger Fracciones

Aplique una presión de bulbo suave para comenzar a eluir la muestra a través de la columna (Figura 2.73a), rellenando la pipeta siempre que el nivel de disolvente se acerque a la capa de arena.
Inmediatamente comenzar a recoger el líquido eluyendo debajo de la columna en un tubo de ensayo vacío. Cambie el tubo de ensayo por uno nuevo periódicamente (Figura 2.73c), según su criterio o la orientación de su instructor (tal vez cuando un pequeño tubo de ensayo se llena hasta aproximadamente\(1 \: \text{cm}\) alto).

Estos diferentes tubos se denominan "fracciones”. El objetivo de una columna es recolectar fracciones lo suficientemente pequeñas como para que la mayoría (o algunas) fracciones contengan material puro. Si la separación de la mezcla es difícil (si la\(\Delta R_f\) de los componentes es baja), puede ser mejor recolectar fracciones aún más pequeñas (por ejemplo,\(0.5 \: \text{cm}\) altas).
Mantenga los tubos de ensayo en orden en una rejilla de tubos de ensayo (Figura 2.73d).

Figura 2.74: a) Placa TLC original, b+c) Fracciones resultantes (de izquierda a derecha en orden de elución).

Encontrar y concentrar el componente deseado

Al encontrar el componente deseado en las fracciones del tubo de ensayo, es útil comprender la relación entre\(R_f\) y el orden de elución en la cromatografía en columna.

En la cromatografía en columna, la muestra se deposita en la parte superior de la columna y se eluye hacia abajo, mientras que en la cromatografía en capa fina la muestra se mancha en el fondo de la placa y se eluye hacia arriba. Por lo tanto, una columna puede pensarse como una placa TLC invertida. Un compuesto con\(R_f\) corridas más altas “más rápido”, lo que significa que terminará más alto en una placa de TLC, y se recolectará primero con una columna.

En la columna de pipetas que se muestra en esta sección, el componente rosa tuvo el mayor\(R_f\) en la placa TLC (Figura 2.74a), y se recolectó primero de la columna (Figura 2.74b). También se colectó una fracción púrpura (Figura 2.74c), debido a la separación incompleta de los componentes rojo y azul.
Use TLC como se describe en la sección de columnas a macroescala para determinar qué tubos contienen el componente deseado.
Combine las fracciones puras en un matraz de fondo redondo de tamaño apropiado usando un embudo, enjuague cada tubo con una pequeña cantidad de eluyente (u otro disolvente si la solubilidad es un problema) y agregue el enjuague al matraz. Retire el disolvente en el evaporador rotatorio.
Para limpiar la columna de pipeta, use presión de bulbo para forzar el exceso de líquido a salir de la columna de pipeta, y deseche la columna semiseca (gel de sílice y todo) en el recipiente de vidrio roto.

Resumen de Columna a Microescala (Pipeta)

Cuadro 2.8: Resumen de procedimiento para cromatografía en columna a microescala (pipeta).

Cuña un poco de algodón en la parte inferior de una pipeta. Use un método de extracción para llenar sílice o alúmina hasta 2-2.5 pulgadas de alto.	Agrega una\(0.5 \: \text{cm}\) capa de arena.	Agregar eluyente a la columna y aplicar presión con un bulbo de pipeta para forzar el eluyente a través de la columna para humedecerlo completamente.	Recuerda romper el sello antes de soltar la bombilla de pipeta, o la succión arruinará la columna. Rellenar la columna con eluyente según sea necesario.

Ajusta el nivel del eluyente a la capa de arena, y luego agrega delicadamente la muestra. Use presión para empujar el eluyente hacia abajo sobre la capa de sílice/alúmina. Enjuague con una porción de eluyente y empuje el disolvente sobre la columna.	Llenar la pipeta con eluyente y aplicar presión para eluir la columna. Recoge líquido en tubos de ensayo. Siempre mantenga húmeda la sección de columna blanca (rellene cada vez que el nivel del eluyente se acerque a la capa de arena).	Cambie los tubos de ensayo periódicamente (tal vez cuando estén\(1 \: \text{cm}\) altos en tubos de ensayo pequeños) para recolectar diferentes fracciones.	Mantenga las fracciones organizadas en una rejilla de tubos de ensayo en el orden en que se eluyan. Use TLC para determinar la pureza de las fracciones y combinar las fracciones apropiadas. Retire el disolvente con el evaporador rotatorio.

\(^{11}\)W.C. Still, M. Kahn, A. Mitra, J. Org. Chem. , Vol. 43, Núm. 14, 1978.