2.5D: Cuantificación con GC

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Desafíos cuantitativos

La mayoría de los instrumentos GC modernos permiten la integración de los picos en un espectro GC con el clic de un botón. Si se usa un instrumento más antiguo, la triangulación se puede usar para calcular el área bajo un pico, o los picos pueden cortarse de un espectro de papel y pesarse en una balanza analítica para integrarse. Las integraciones de picos son útiles porque es posible correlacionar el área bajo un pico con la cantidad de material presente en una muestra. Tenga en cuenta que es el área de un pico lo que es relevante, no la altura. Un pico alto y estrecho puede tener un área más pequeña que uno corto y ancho. Sería muy útil que las áreas de pico reflejaran directamente la composición de la mezcla, pero desgraciadamente no siempre es así. La razón de esto tiene que ver con cómo se detectan los compuestos al salir de una columna.

Los detectores comunes en las instituciones de pregrado son los detectores de ionización de llama (FID) y los detectores de espectrometría de masas (MS). Con un FID, una muestra se enciende al salir de la columna, y los iones producidos en la llama son “contados” por la cantidad de corriente eléctrica. Desafortunadamente, diferentes compuestos producen diferentes cantidades de iones cuando se queman, lo que significa que el recuento de iones no será directamente equivalente a la cantidad molar. De igual manera, un espectrómetro de masas cuenta el número de iones producidos a partir de todos los fragmentos detectados en el instrumento (denominado “Total Ion Count”, TIC, el eje y en la Figura 2.84), que no siempre representa directamente la cantidad del material original. Algunos compuestos se fragmentan más que otros en un espectrómetro de masas, provocando que se detecten de una manera que no representa su verdadera abundancia.

Para demostrar cómo la integración de picos no siempre se correlaciona con la abundancia real, en la Figura 2.84 se muestran los espectros GC de dos muestras que contienen cantidades equimolares de dos compuestos. La Figura 2.84a contiene cantidades molares iguales de 1-butanol y 2-butanol, mientras que la Figura 2.84b contiene cantidades molares iguales de 2-butanol y 1-heptanol.

El área bajo los picos fue tabulada por el espectrómetro de masas (representada por la columna indicada por una flecha en cada Figura), y fue casi\(50\%\) para cada componente en el sistema de butanol (Figura 2.84a). En este caso, los porcentajes generados por el instrumento fueron casi idénticos a la verdadera composición (¡aunque no es probable que alcancen cinco cifras significativas!).

Sin embargo, la muestra que contenía cantidades equimolares de 2-butanol y 1-heptanol se reportó como\(80\%\) composición a\(\sim 20\%\) - (Figura 2.84b). La verdadera composición de la mezcla es\(50\%\) de cada componente, pero los compuestos se “cuentan” desproporcionadamente. En esta situación, las integraciones no representan la verdadera abundancia ya que el 1-heptanol forma más fragmentos en su espectro de masas que el 2-butanol, por lo que se “cuenta” con mayor frecuencia.

Es una regla general que las integraciones en un espectro de GC (los porcentajes) se pueden usar directamente como una primera aproximación de la composición verdadera al comparar isómeros (por ejemplo, 1-butanol y 2-butanol). Cuando se comparan compuestos que son de diferentes tamaños (por ejemplo, 2-butanol y 1-heptanol), los porcentajes reportados pueden necesitar traducirse en porcentajes reales usando una curva de calibración o factores de respuesta.

Uso de una curva de calibración

Un método para traducir los valores de integración dados por el instrumento GC en porcentajes significativos que reflejen la composición de la mezcla es usar una curva de calibración. Para generar una curva de calibración, se inyectan muestras estándar de relaciones molares o másicas conocidas en el GC y se registran los porcentajes reportados por el instrumento. El gráfico de la Figura 2.85 muestra dicha curva de calibración para una mezcla de 2-butanol/1-heptanol, detectada por un espectrómetro de masas.

Por ejemplo, si se inyectara en el instrumento una mezcla conocida por ser \(60 \: \text{mol}\%\)2-butanol y\(40 \: \text{mol}\%\) 1-heptanol, y el espectro GC resultante reportara que la mezcla era \(42\%\)2-butanol y\(58\%\) 1-heptanol, este punto de datos se registraría en la gráfica como (60,42), utilizando únicamente el porcentaje de 2-butanol para simplificar la situación. Se podrían analizar más puntos de datos usando varias relaciones molares conocidas de 2-butanol y 1-heptanol.

Gráfica de mezclas de 2-butanol/1-heptanol contra el porcentaje molar real de 2-butanol. — Figura 2.85: Los porcentajes molares conocidos de 2-butanol en una mezcla de 2-butanol/1-heptanol se correlacionan con el GC reportado\(\%\) de 2-butanol.

La curva de calibración se puede utilizar para correlacionar valores reportados por el instrumento GC en abundancias verdaderas. Imagínese que una muestra que contiene solo 2-butanol y 1-heptanol es inyectada en el GC y reportada por el instrumento como \(70\%\)2-butanol. Usando la curva de calibración de la Figura 2.85, un valor medido de \(70\%\)2-butanol (eje y) se correlaciona con un valor real de aproximadamente \(87\)\(\text{mol}\%\)2-butanol (eje x). Por lo tanto, una muestra reportada por el instrumento GC como\(70/30\%\) 2-butanol/1-heptanol, en realidad está más cerca de\(87/13\%\) 2-butanol/1-heptanol.

Debido a la naturaleza aproximada de este método, los valores porcentuales nunca deben reportarse con más precisión que el lugar de uno, y probablemente el verdadero error sea del orden de\(\pm 5\%\).

Uso de factores de respuesta

Otro método que se puede utilizar para traducir los valores de integración dados por el instrumento GC en porcentajes significativos es utilizar un factor de respuesta. Una muestra que contiene cantidades equimolares de los compuestos a analizar se inyecta en el GC y las áreas de los picos se traducen numéricamente en sensibilidades de los compuestos.

Este proceso se demostrará con una mezcla que contiene solo 2-butanol y 1-heptanol. La Figura 2.86 muestra el espectro GC de una muestra que contiene cantidades equimolares de 2-butanol y 1-heptanol.

Figura 2.86: Espectro de GC generado a partir de una muestra que contenía cantidades equimolares de 2-butanol y 1-heptanol.

Los picos deben tener integraciones iguales porque los compuestos están presentes en cantidades molares iguales, pero el pico en\(2.38 \: \text{min}\) (1-heptanol) es “contando” más de lo que debería. En el reporte cuantitativo se puede utilizar la columna con el encabezado “corr.area”, ya que ésta muestra el área calculada de cada pico. La relación de estos recuentos de área (ver cálculo a continuación) da un valor de 3.86, lo que significa que se detecta 1-heptanol 3.86 veces “mejor” que el 2-butanol en estas mezclas.

\[\text{Ratio of corrected areas} = \frac{34558086 \: \text{area counts for 1-heptanol}}{8955039 \: \text{area counts for 2-butanol}} = 3.86\]

Para utilizar este factor de respuesta en correlacionar valores reportados por el instrumento GC en abundancias verdaderas, imagine que una muestra que contiene solo 2-butanol y 1-heptanol es reportada por el GC como\(30\%\) 1-heptanol (30 recuentos de área de 1-heptanol por cada 70 recuentos de área de 2-butanol). Como el 1-heptanol es 3.86 veces más sensible que el 2-butanol, los recuentos de área verdaderos se representarían con mayor precisión como recuentos de\(30/3.86 = 7.77\) área de 1-heptanol por cada 70 recuentos de área de 2-butanol. \(^{15}\)

\[\frac{30 \: \text{area counts for 1-heptanol}}{70 \: \text{area counts for 2-butanol}} \rightarrow \frac{30/3.86 \: \text{(1-heptanol)}}{70 \: \text{(2-butanol)}} = \frac{7.77 \: \text{(1-heptanol)}}{70 \: \text{(2-butanol)}}\]

Estos hipotéticos (y aún más precisos) recuentos de área se pueden convertir entonces en porcentajes, de la siguiente manera:

\[\% \: \text{1-heptanol} = \frac{7.77 \: \text{(1-heptanol)} \times 100\%}{70 + 7.77 \: \text{(total)}} = 10\% \: \text{1-heptanol, (meaning} \: 90\% \: \text{2-butanol)}\]

Por lo tanto, una muestra reportada por el instrumento GC como\(70/30\%\) 2-butanol/1-heptanol, en realidad está más cerca de\(90/10\%\) 2-butanol/1-heptanol, que es un valor similar a lo que se podría encontrar usando una curva de calibración.

\(^{15}\)Estos cálculos podrían realizarse de manera más sucinta y con mayor precisión utilizando los recuentos reales de área para cada pico, que se encuentran en la columna “corr.area” de un reporte cuantitativo de GC.