14.2: Verificación del Método
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Después de desarrollar y optimizar un método, el siguiente paso es determinar qué tan bien funciona en manos de un solo analista. Tres pasos conforman este proceso: determinar las características de un solo operador, completar un análisis ciego de estándares y determinar la robustez del método. Si hay otro método estándar disponible, entonces podemos analizar la misma muestra usando tanto el método estándar como el nuevo método, y comparar los resultados. Si el resultado de una sola prueba es inaceptable, entonces el método no es un método estándar adecuado.
Características de un solo operador
El primer paso para verificar un método es determinar la precisión, precisión y límite de detección cuando un solo analista usa el método para analizar una muestra estándar. El límite de detección se determina analizando un blanco de reactivo apropiado. La precisión se determina analizando porciones replicadas de la muestra, preferiblemente más de diez. La precisión se evalúa mediante una prueba t para comparar los resultados experimentales con la cantidad conocida de analito en el estándar. La precisión y la precisión se evalúan para varias concentraciones diferentes de analito, incluyendo al menos una concentración cerca del límite de detección, y para cada matriz de muestra diferente. Incluir diferentes concentraciones de analito ayuda a identificar fuentes constantes de error determinado y a establecer el rango de concentraciones para el cual es aplicable el método.
Análisis Ciego de Muestras Estándar
Las características de un solo operador se determinan analizando una muestra estándar que tiene una concentración de analito conocida por el analista. El segundo paso para verificar un método es un análisis ciego de muestras estándar. Aunque la concentración de analito en el estándar es conocida por un supervisor, la información es retenida al analista. Después de analizar la muestra estándar varias veces, la concentración promedio del analito es reportada al supervisor de la prueba. Para ser aceptado, la media experimental debe estar dentro de tres desviaciones estándar, determinadas a partir de las características de un solo operador, de la concentración conocida del analito.
Un requisito aún más estricto es exigir que la media experimental esté dentro de dos desviaciones estándar de la concentración conocida del analito.
Pruebas de robustez
Un método optimizado puede producir excelentes resultados en el laboratorio que desarrolla un método, pero malos resultados en otros laboratorios. Esto no es particularmente sorprendente porque un método generalmente es optimizado por un solo analista usando los mismos reactivos, equipo e instrumentación para cada prueba. Cualquier variabilidad introducida por diferentes analistas, reactivos, equipos e instrumentación no se incluye en las características de un solo operador. Otros factores menos obvios pueden afectar un análisis, incluyendo factores ambientales, como la temperatura o humedad relativa en el laboratorio; si el procedimiento no requiere el control de estas condiciones, entonces pueden contribuir a la variabilidad. Por último, el analista que optimiza el método suele tener especial cuidado de realizar el análisis exactamente de la misma manera durante cada ensayo, lo que puede minimizar la variabilidad entre series.
Un paso importante en el desarrollo de un método estándar es determinar qué factores tienen un efecto pronunciado en la calidad de los resultados. Una vez que identificamos estos factores, podemos escribir instrucciones específicas que especifiquen cómo deben controlarse estos factores. Un procedimiento que, cuando se sigue cuidadosamente, produce resultados de alta calidad en diferentes laboratorios se considera rugoso. El método por el cual se descubren los factores críticos se llama prueba de robustez [Youden, W. J. Anal. Chem. 1960, 32 (13), 23A—37A].
Por ejemplo, si la temperatura es una preocupación, podríamos especificar que se mantenga a\(25 \pm 2\) o C.
Las pruebas de robustez suelen ser realizadas por el laboratorio que desarrolla el método estándar. Después de identificar los factores potenciales, se evalúan sus efectos sobre la respuesta realizando el análisis en dos niveles para cada factor. Normalmente un nivel es el especificado en el procedimiento, y el otro es un nivel probable que se encuentre cuando el procedimiento es utilizado por otros laboratorios.
Este enfoque para las pruebas de robustez puede llevar mucho tiempo. Si hay siete factores potenciales, por ejemplo, un diseño factorial de 2 7 puede evaluar el efecto de primer orden de cada factor. Desafortunadamente, esto requiere un total de 128 juicios, demasiados juicios para ser una solución práctica. Un diseño experimental más simple se muestra en la Tabla 14.2.1 , en la que los dos niveles de factores se identifican por letras mayúsculas y minúsculas. Este diseño, que es similar a un diseño factorial 2 3, se denomina diseño factorial fraccional. Debido a que solo incluye ocho corridas, el diseño proporciona información solo la respuesta promedio y los siete efectos factoriales de primer orden. No proporciona información suficiente para evaluar efectos de orden superior o interacciones entre factores, los cuales son probablemente menos importantes que los efectos de primer orden.
El diseño experimental en la Tabla 14.2.1 está equilibrado en que cada uno de los dos niveles de un factor se empareja un número igual de veces con los niveles de mayúsculas y minúsculas para cada otro factor. Para determinar el efecto, E, de cambiar el nivel de un factor, restamos la respuesta promedio cuando el factor está en su nivel de mayúsculas del valor promedio cuando está en su nivel de minúsculas.
Debido a que el diseño es equilibrado, los niveles para los factores restantes aparecen igual número de veces en ambos términos de suma, cancelando su efecto sobre E. Por ejemplo, para determinar el efecto del factor A, E A, restamos la respuesta promedio para las series 5—8 de la respuesta promedio para las series 1—4. El factor B no afecta a E porque sus niveles de mayúsculas en las carreras 1 y 2 son cancelados por los niveles de mayúsculas en las carreras 5 y 6, y sus niveles en minúsculas en las carreras 3 y 4 son cancelados por los niveles de minúsculas en las carreras 7 y 8. Después de calcular cada uno de los efectos factoriales los clasificamos de mayor a menor sin tener en cuenta el signo, identificando aquellos factores cuyos efectos son sustancialmente mayores que los otros factores.
Para ver que esto es el diseño es equilibrado, mira de cerca las últimas cuatro carreras. El factor A está presente en su nivel a para las cuatro carreras. Para cada uno de los factores restantes, dos niveles son mayúsculas y dos niveles son minúsculas. Las series 5—8 proporcionan información sobre el efecto de a en la respuesta, pero no proporcionan información sobre el efecto de ningún otro factor. Las carreras 1, 2, 5 y 6 proporcionan información sobre el efecto de B, pero no de los factores restantes. Prueba algunos otros ejemplos para convencerte de que esta relación es general.
También podemos utilizar este diseño experimental para estimar la desviación estándar esperada del método debido a los efectos de pequeños cambios en factores no controlados o mal controlados [Youden, W. J. “Statistical Techniques for Collaborative Tests”, en Statistical Manual of the Association of Official Analytical Químicos, Asociación de Químicos Analíticos Oficiales: Washington, D. C., 1975, p. 35].
\[s=\sqrt{\frac{2}{7} \sum_{i=1}^{n} E_{i}^{2}} \label{14.2}\]
Si esta desviación estándar es demasiado grande, entonces se modifica el procedimiento para poner bajo control los factores que tienen mayor efecto en la respuesta.
¿Por qué este modelo estima los siete efectos factoriales de primer orden, E, y no siete de las 20 posibles interacciones de primer orden? Con ocho experimentos, solo podemos elegir calcular siete parámetros (más la respuesta promedio). El cálculo de E D, por ejemplo, también da el valor para E AB. Puedes convencerte de esto reemplazando cada letra mayúscula por a\(+1\) y cada letra minúscula con a\(-1\) y señalando eso\(A \times B = D\). Elegimos reportar los efectos factoriales de primer orden porque probablemente son más importantes que las interacciones entre factores.
La concentración de metales traza en muestras de sedimentos recolectadas de ríos y lagos se determina extrayendo con ácido y analizando el extracto mediante espectrofotometría de absorción atómica. Un procedimiento requiere una extracción durante la noche utilizando HCl diluido o HNO 3. Las muestras se colocan en botellas de plástico con 25 mL de ácido y luego se colocan en un agitador operado a una velocidad moderada y a temperatura ambiente. Para determinar la robustez del método, se estudió el efecto de los siguientes factores utilizando el diseño experimental en la Tabla 14.2.1 .
| Factor A: tiempo de extracción | A = 24 h | a = 12 h |
| Factor B: velocidad de agitación | B = medio | b = alto |
| Factor C: tipo ácido | C = HCl | c = HNO 3 |
| Factor D: concentración de ácido | D = 0.1 M | d = 0.05 M |
| Factor E: volumen de ácido | E = 25 mL | e = 35 mL |
| Factor F: tipo de contenedor | F = plástico | f = vidrio |
| Factor G: temperatura | G = ambiente | g = 25 o C |
Ocho repeticiones de una muestra estándar que contiene una cantidad conocida de analito se transportan a través del procedimiento. El porcentaje de analito recuperado en las ocho muestras son los siguientes: R 1 = 98.9, R 2 = 99.0, R 3 = 97,5, R 4 = 97.7, R 5 = 97,4, R 6 = 97.3, R 7 = 98.6, y R 8 = 98.6. Identificar los factores que tienen un efecto significativo en la respuesta y estimar la desviación estándar esperada del método.
Solución
Para calcular el efecto de cambiar el nivel de cada factor utilizamos la Ecuación\ ref {14.1} y la sustituimos en los valores apropiados. Por ejemplo, E A es
\[E_{A}=\frac{98.9+99.0+97.5+97.7}{4} - \frac{97.4+97.3+98.6+98.6}{4}=0.30 \nonumber\]
Completar los cálculos restantes y ordenar los factores por los valores absolutos de sus efectos
Factor D = 1.30, Factor A = 0.35, Factor E = — 0.10, Factor B = 0.05, Factor C = — 0.05, Factor F = 0.05, Factor G = 0.00
nos muestra que la concentración de ácido (Factor D) tiene un efecto sustancial en la respuesta, con una concentración de 0.05 M proporcionando un porcentaje de recuperación mucho menor. El tiempo de extracción (Factor A) también parece significativo, pero su efecto no es tan importante como la concentración del ácido. Todos los demás factores parecen insignificantes. La desviación estándar estimada del método es
\[s = \sqrt{\frac {2} {7} \times \left[ (1.30)^2 + (0.35)^2 + (-0.10)^2 + (0.05)^2 + (-0.05)^2 + (0.05)^2 + (0.00)^2 \right]} = 0.72 \nonumber\]
lo que, para una recuperación promedio de 98.1% da una desviación estándar relativa de aproximadamente 0.7%. Si controlamos la concentración del ácido para que su efecto se acerque a eso para los factores B, C y F, entonces la desviación estándar relativa se convierte en 0.18, o aproximadamente 0.2%.
Pruebas de equivalencia
Si se dispone de un método estándar aprobado, entonces se debe evaluar un nuevo método comparando los resultados con los obtenidos al usar el método estándar. Normalmente esta comparación se realiza a un mínimo de tres concentraciones de analito para evaluar el nuevo método en un amplio rango dinámico. Alternativamente, podemos graficar los resultados obtenidos usando el nuevo método contra los resultados obtenidos usando el método estándar aprobado. Una pendiente de 1.00 y una intersección y de 0.0 proporciona evidencia de que los dos métodos son equivalentes.