8: Técnicas básicas
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El ambiente de una célula es muy complejo, lo que dificulta el estudio de reacciones individuales, enzimas o vías in situ. El enfoque tradicional utilizado por los bioquímicos para el estudio de estas cosas es aislar moléculas, enzimas, ADN, ARN y otros elementos de interés para que puedan analizarse independientemente de los millones de otros procesos que ocurren simultáneamente. Hoy en día, estos enfoques se utilizan codo con codo con métodos más nuevos que nos permiten comprender eventos dentro de las células a mayor escala, por ejemplo, determinando todos los genes que se están expresando en un momento dado en células específicas. En esta sección echamos un breve vistazo a algunos métodos comúnmente utilizados para estudiar moléculas biológicas y sus interacciones.
- 8.1: Lisis celular
- Para separar los compuestos de los ambientes celulares, primero hay que romper (lisar) las células. Las células se abren por rotura, en soluciones tamponadas, para obtener un lisado. Hay varias formas de lograrlo.
- 8.2: Técnicas de Fraccionamiento y Cromatografía
- El fraccionamiento de muestras, como su nombre indica, es un proceso de separación de los componentes o fracciones del lisado. El fraccionamiento generalmente comienza con la centrifugación del lisado. Mediante centrifugación a baja velocidad, se pueden eliminar los restos celulares, dejando un sobrenadante que contiene el contenido de la célula. Mediante el uso de velocidades de centrifugación sucesivamente más altas (y las fuerzas g resultantes) es posible separar diferentes componentes celulares, como núcleos, mitocondrias, etc., del citoplasma.
- 8.3: Electroforesis
- La electroforesis utiliza un campo eléctrico aplicado a través de una matriz de gel para separar moléculas grandes como ADN, ARN y proteínas por carga y tamaño. Las muestras se cargan en los pocillos de una matriz de gel que puede separar moléculas por tamaño y se aplica un campo eléctrico a través del gel. Este campo hace que las moléculas cargadas negativamente se muevan hacia el electrodo positivo. La matriz de gel, en sí misma, actúa como un tamiz, a través del cual las moléculas más pequeñas pasan rápidamente, mientras que las moléculas más largas son de movimiento más lento
- 8.4: Detección, identificación y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas específicos
- “Una forma de detectar la presencia de un ácido nucleico o proteína particular depende de transferir las moléculas separadas de los geles a una membrana hecha de nitrocelulosa o nylon para crear una “" transferencia "” y sondear la (s) molécula (s) de interés usando reactivos que se unen específicamente a esas moléculas.” En la siguiente sección se discutirá cómo se puede hacer esto tanto para los ácidos nucleicos como para las proteínas.
- 8.5: Transcriptómica
- Considere una matriz que contenga todas las secuencias génicas conocidas en un genoma. Para hacer tal matriz para su análisis, se necesitaría hacer copias de cada gen, ya sea por síntesis química o usando PCR. Las cadenas de los ADN resultantes se separarían entonces para obtener secuencias monocatenarias que podrían unirse al chip. Cada caja de la cuadrícula contendría la secuencia de un gen. Se podría analizar el transcriptoma - todos los ARNm se hacen en células seleccionadas en un momento dado.
- 8.6: Aislamiento de genes
- Los métodos para aislar genes no estuvieron disponibles hasta la década de 1970, cuando el descubrimiento de enzimas de restricción y la invención de la clonación molecular proporcionaron, por primera vez, formas de obtener grandes cantidades de fragmentos específicos de ADN, para su estudio. Si bien, con el propósito de obtener grandes cantidades de un fragmento de ADN específico, la clonación molecular ha sido reemplazada en gran medida por amplificación directa utilizando la reacción en cadena de la polimerasa descrita más adelante, los ADN clonados siguen siendo muy útiles por diversas razones.
- 8.7: Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)
- La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite utilizar el poder de replicación del ADN para amplificar enormemente el ADN en un corto período de tiempo. Como saben, las células replican su ADN antes de dividirse, y al hacerlo, duplican la cantidad de ADN de la célula. La PCR imita esencialmente la replicación del ADN celular en el tubo de ensayo, copiando repetidamente el ADN diana una y otra vez, para producir grandes cantidades del ADN deseado.
- 8.8: Transcripción inversa
- En el dogma central, el ADN codifica ARNm, que codifica para proteína. Una excepción conocida al dogma central es exhibida por los retrovirus. Estos virus codificados por ARN tienen una fase en su ciclo de vida en la que su ARN genómico es convertido de nuevo en ADN por una enzima codificada viralmente conocida como transcriptasa inversa. La capacidad de convertir ARN en ADN es un método que es deseable en el laboratorio por numerosas razones.
- 8.9: FRET
- La técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se basa en la observación de que una molécula excitada por la absorción de luz puede transferir energía a una molécula cercana si el espectro de emisión de la primera molécula se solapa con el espectro de excitación de la segunda. Esta transferencia de energía solo puede tener lugar si las dos moléculas están suficientemente juntas (no más de unos pocos nanómetros de distancia.
- 8.10: Edición del Genoma (CRISPR)
- El desarrollo de herramientas que permitirían a los científicos realizar cambios específicos y específicos en el genoma ha sido el Santo Grial de la biología molecular. Una nueva herramienta ingeniosa que es simple y efectiva para realizar cambios precisos está preparada para revolucionar el campo, al igual que lo hizo la PCR en la década de 1980. Conocido como el sistema CRISPR/Cas9, y a menudo abreviado simplemente como CRISPR, se basa en una especie de sistema inmune bacteriano que permite a las bacterias reconocer e inactivar a los invasores virales.
- 8.11: Escisión de Proteína
- Debido a su gran tamaño, las proteínas intactas pueden ser difíciles de estudiar utilizando técnicas analíticas, como la espectrometría de masas. En consecuencia, a menudo es deseable descomponer un polipéptido grande en trozos más pequeños. Las proteasas son enzimas que típicamente rompen los enlaces peptídicos al unirse a secuencias de aminoácidos específicas en una proteína y catalizar su hidrólisis.
- 8.12: Dinámica de Membranas (FRAP)
- Comprender la dinámica del movimiento en las membranas de las células es la provincia de la técnica de Recuperación de Fluorescencia Después del Fotoblanqueo (FRAP). Esta técnica óptica se utiliza para medir la difusión lateral bidimensional de moléculas en películas delgadas, como membranas, utilizando sondas marcadas fluorescentemente. También tiene aplicaciones en la unión a proteínas.
Miniaturas: Una transferencia western. Imagen utilizada con permiso (CC BY-SA 3.0; Magnus Manske).